Informatie

Hoe kan ik beschrijven dat ik een oplossing vier keer door een chromatografie-eenheid laat lopen (in een instructie)?


Ik vertaal een document uit het Russisch:

De gemiddelde retentietijd voor de eerste vier injecties met RNase moet (40,8 ± 2) minuten zijn. Als de gemiddelde RT buiten dit bereik ligt, past u het gradiëntsysteem aan (wijzig het gehalte aan acetonitril binnen het bereik van 20% - 32%) en chromatograaf de RNase-oplossing vier keer.

Ik ben me ervan bewust dat we niet gebruiken chromatograaf meestal als een werkwoord in het Engels, maar we gebruiken het op deze manier in het Russisch. Wat zou de generieke Engelse uitdrukking hiervoor zijn, bruikbaar in een procedurebeschrijving? Ik weet dat we het woord hebben loop maar dit is misschien te informeel voor een officiële krant.


Ik zou gewoon zeggen:

herhaal de chromatografie vier keer

of minder formeel, maar heel acceptabel:

herhaal de kolom (of wat het ook is) vier keer

Dit legt de nadruk op het proces.

Maar ik weet niet precies wat er gebeurt. Je hebt vier injecties met RNAase. Als ze niet juist zijn, herhaal je ze dan allemaal of wat? Als de eerste, dan zou het zijn:

herhaal de chromatografie (of voer de kolom opnieuw uit) voor elk monster


Ik zou blijven gebruikeninjecterenom het laden van monsters in het vloeistofchromatografiesysteem te beschrijven en te vervangen

chromatografeer de RNAase-oplossing vier keer.

met

injecteer de RNAase-oplossing nog eens vier keer.


Het verschil tussen retentietijd en relatieve retentietijd begrijpen

Retentietijd (RT) is een maat voor de tijd die een opgeloste stof nodig heeft om door een chromatografiekolom te gaan. Het wordt berekend als de tijd van injectie tot detectie.

De RT voor een verbinding staat niet vast, omdat veel factoren deze kunnen beïnvloeden, zelfs als dezelfde GC en kolom worden gebruikt. Waaronder:

  • De gasstroomsnelheid:
  • Temperatuurverschillen in de oven en kolom
  • Kolomdegradatie
  • Kolom lengte

Deze factoren kunnen het moeilijk maken om bewaartijden te vergelijken. Zelfs als u dezelfde GC slechts een paar dagen na elkaar gebruikt, kunnen er kleine verschillen zijn in de retentietijd van een verbinding.


Samenvatting dunnelaagchromatografie

Plaats een kleine hoeveelheid oplosmiddel ((5)-(10 : ext) voor deze kamer) in een TLC-kamer met deksel, samen met een gesneden stuk filtreerpapier.

Los vloeibare of vaste monsters op (1 druppel per (sim 1 : ext .)) oplosmiddel) met een laagkokend oplosmiddel (bijv. aceton of dichloormethaan).

Teken een potloodlijn op een TLC-plaat (sim 1 : ext) vanaf de onderkant met een liniaal en markeer de banen.

Leg rijstroken niet te dicht bij de rand of bij elkaar.

Zoek een verdund monster op de potloodlijn van de juiste baan, maak zeer kleine vlekken ((2 : ekst) in diameter).

Spoel de spotter af met een oplosmiddel (bijv. aceton) als u hem voor een ander monster gaat gebruiken.

Plaats het monster in de TLC-kamer met een pincet, sluit het af en laat het met rust.

Verwijder de plaat wanneer de oplosmiddellijn (sim 0,5 : ext . is) vanaf het begin.

Markeer onmiddellijk de lijn van het oplosmiddel met een potlood.

Tabel 2.3: Procedurele samenvatting voor TLC.


Scheidingstechnieken: chromatografie

Chromatografie is een belangrijke biofysische techniek die de scheiding, identificatie en zuivering van de componenten van een mengsel mogelijk maakt voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse. Eiwitten kunnen worden gezuiverd op basis van kenmerken zoals grootte en vorm, totale lading, hydrofobe groepen op het oppervlak en bindingscapaciteit met de stationaire fase. Vier scheidingstechnieken op basis van moleculaire kenmerken en interactietype gebruiken mechanismen van ionenuitwisseling, oppervlakteadsorptie, partitie en uitsluiting van grootte. Andere chromatografietechnieken zijn gebaseerd op het stationaire bed, waaronder kolom-, dunnelaag- en papierchromatografie. Kolomchromatografie is een van de meest gebruikelijke methoden voor eiwitzuivering.

Chromatografie is gebaseerd op het principe waarbij moleculen die gemengd worden aangebracht op het oppervlak of in de vaste en vloeibare stationaire fase (stabiele fase) van elkaar scheiden terwijl ze bewegen met behulp van een mobiele fase. De factoren die effectief zijn bij dit scheidingsproces omvatten moleculaire kenmerken die verband houden met adsorptie (vloeibaar-vast), verdeling (vloeibaar-vast) en affiniteit of verschillen tussen hun molecuulgewichten [1, 2]. Vanwege deze verschillen blijven sommige componenten van het mengsel langer in de stationaire fase en bewegen ze langzaam in het chromatografiesysteem, terwijl andere snel in de mobiele fase overgaan en het systeem sneller verlaten [3].

Op basis van deze benadering vormen drie componenten de basis van de chromatografietechniek.

Stationaire fase: Deze fase is altijd samengesteld uit een “solid” fase of 𠇊 laag van een vloeistof geadsorbeerd op het oppervlak een vaste drager”.

Mobiele fase: Deze fase is altijd samengesteld uit “vloeistof” of een “gasvormig bestanddeel.”

Het type interactie tussen stationaire fase, mobiele fase en stoffen in het mengsel is de basiscomponent die effectief is bij het scheiden van moleculen van elkaar. Chromatografiemethoden op basis van partitie zijn zeer effectief bij scheiding en identificatie van kleine moleculen als aminozuren, koolhydraten en vetzuren. Affiniteitschromatografieën (dwz ionenuitwisselingschromatografie) zijn echter effectiever in de scheiding van macromoleculen als nucleïnezuren en eiwitten. Papierchromatografie wordt gebruikt bij de scheiding van eiwitten, en in studies met betrekking tot eiwitsynthese wordt gas-vloeistofchromatografie gebruikt bij de scheiding van alcohol-, ester-, lipide- en aminogroepen en observatie van enzymatische interacties, terwijl moleculaire zeefchromatografie wordt gebruikt speciaal voor de bepaling van molecuulgewichten van eiwitten. Agarose-gelchromatografie wordt gebruikt voor de zuivering van RNA, DNA-deeltjes en virussen [4].

Stationaire fase in chromatografie is een vaste fase of een vloeibare fase die is gecoat op het oppervlak van een vaste fase. Mobiele fase die over de stationaire fase stroomt, is een gasvormige of vloeibare fase. Als de mobiele fase vloeibaar is, wordt dit vloeistofchromatografie (LC) genoemd en als het gas is, wordt het gaschromatografie (GC) genoemd. Gaschromatografie wordt toegepast voor gassen, en mengsels van vluchtige vloeistoffen en vaste stoffen. Vloeistofchromatografie wordt vooral gebruikt voor thermisch onstabiele en niet-vluchtige monsters [5].

Het doel van het toepassen van chromatografie, die naast de scheiding als methode voor kwantitatieve analyse wordt gebruikt, is om binnen een geschikt tijdsinterval een bevredigende scheiding te bereiken. Daartoe zijn verschillende chromatografiemethoden ontwikkeld. Sommigen van hen omvatten kolomchromatografie, dunnelaagchromatografie (TLC), papierchromatografie, gaschromatografie, ionenuitwisselingschromatografie, gelpermeatiechromatografie, hogedrukvloeistofchromatografie en affiniteitschromatografie [6].

Soorten chromatografie

Gel-permeatie (moleculaire zeef) chromatografie

Hydrofobe interactiechromatografie

Hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC)

Kolomchromatografie

Omdat eiwitten verschillende karakteristieke kenmerken hebben zoals grootte, vorm, netto lading, gebruikte stationaire fase en bindingscapaciteit, kan elk van deze karakteristieke componenten worden gezuiverd met behulp van chromatografische methoden. Van deze methoden wordt meestal kolomchromatografie toegepast. Deze techniek wordt gebruikt voor de zuivering van biomoleculen. Op een kolom (stationaire fase) wordt eerst het te scheiden monster en daarna wasbuffer (mobiele fase) aangebracht (Figuur 1). Hun doorstroming door het binnenste kolommateriaal dat op een glasvezeldrager is geplaatst, is verzekerd. De monsters worden op een tijd- en volumeafhankelijke manier onderin het apparaat verzameld [7].

Ionenuitwisselingschromatografie

Ionenuitwisselingschromatografie is gebaseerd op elektrostatische interacties tussen geladen eiwitgroepen en vast dragermateriaal (matrix). Matrix heeft een ionenbelasting die tegengesteld is aan die van het te scheiden eiwit, en de affiniteit van het eiwit voor de kolom wordt bereikt met ionische bindingen. Eiwitten worden van de kolom gescheiden door de pH, de concentratie van ionzouten of de ionsterkte van de bufferoplossing te veranderen [8]. Positief geladen ionenuitwisselingsmatrices worden anionenuitwisselingsmatrices genoemd en adsorberen negatief geladen eiwitten. Terwijl matrices gebonden met negatief geladen groepen bekend staan ​​als kation-uitwisselingsmatrices, en positief geladen eiwitten adsorberen (Figuur 2) [9].

Ionenuitwisselingschromatografie.

Gelpermeatie (moleculaire zeef) chromatografie

Het basisprincipe van deze methode is om dextran-bevattende materialen te gebruiken om macromoleculen te scheiden op basis van hun verschillen in molecuulgroottes. Deze procedure wordt in principe gebruikt om molecuulgewichten van eiwitten te bepalen en om zoutconcentraties van eiwitoplossingen te verlagen [10]. In een gelpermeatiekolom bestaat de stationaire fase uit inerte moleculen met kleine poriën. De oplossing die moleculen van verschillende afmetingen bevat, wordt continu met een constante stroomsnelheid door de kolom geleid. Moleculen die groter zijn dan poriën kunnen niet doordringen in geldeeltjes en ze worden vastgehouden tussen deeltjes binnen een beperkt gebied. Grotere moleculen gaan door ruimten tussen poreuze deeltjes en bewegen snel door de kolom. Moleculen die kleiner zijn dan de poriën worden verspreid in de poriën en naarmate moleculen kleiner worden, verlaten ze de kolom met proportioneel langere retentietijden (Figuur 3) [11]. Sephadeks G-type is het meest gebruikte kolommateriaal. Daarnaast worden ook dextran, agorose en polyacrylamide gebruikt als kolommaterialen [12].

Gel-permeatie (moleculaire zeef) chromatografie.

Affiniteitschromatografie

Deze chromatografietechniek wordt gebruikt voor de zuivering van enzymen, hormonen, antilichamen, nucleïnezuren en specifieke eiwitten [13]. Een ligand die een complex kan maken met een specifiek eiwit (dextraan, polyacrylamide, cellulose enz.) bindt het vulmateriaal van de kolom. Het specifieke eiwit dat een complex vormt met het ligand wordt aan de vaste drager (matrix) gehecht en in de kolom vastgehouden, terwijl vrije eiwitten de kolom verlaten. Vervolgens verlaat het gebonden eiwit de kolom door middel van verandering van de ionsterkte door wijziging van de pH of toevoeging van een zoutoplossing (Figuur 4) [14].

Papierchromatografie

Bij papierchromatografie bestaat dragermateriaal uit een laag cellulose die sterk verzadigd is met water. Bij deze methode vormde een dik filtreerpapier de drager en waterdruppels vestigden zich in de poriën en vormden de stationaire vloeibare fase. De mobiele fase bestaat uit een geschikte vloeistof die in een ontwikkeltank wordt geplaatst. Papierchromatografie is een 'vloeistof-vloeistof'-chromatografie [15].

Dunnelaagchromatografie

Dunnelaagchromatografie is een 'vast-vloeistof-adsorptie'-chromatografie. Bij deze methode is de stationaire fase een vaste adsorberende stof die op glasplaten is aangebracht. Als adsorberend materiaal worden alle vaste stoffen gebruikt. in kolomchromatografie (aluminiumoxide, silicagel, cellulose) kan worden gebruikt. Bij deze methode gaat de mobiele fase omhoog door de stationaire fase. Het oplosmiddel gaat door capillaire werking omhoog over de dunne plaat die doordrenkt is met het oplosmiddel. Tijdens deze procedure drijft het ook het mengsel dat eerder op de onderste delen van de plaat is gevallen met een pipet naar boven met verschillende stroomsnelheden. Aldus wordt de scheiding van analyten bereikt. Deze opwaartse bewegingssnelheid hangt af van de polariteit van het materiaal, de vaste fase en van het oplosmiddel [16].

In gevallen waarin moleculen van het monster kleurloos zijn, kan fluorescentie, radioactiviteit of een specifieke chemische stof worden gebruikt om een ​​zichtbaar gekleurd reactief product te produceren om hun posities op het chromatogram te identificeren. Vorming van een zichtbare kleur kan worden waargenomen onder kamerlicht of UV-licht. De positie van elk molecuul in het mengsel kan worden gemeten door de verhouding te berekenen tussen de afstanden die het molecuul en het oplosmiddel aflegt. Deze meetwaarde wordt relatieve mobiliteit genoemd en wordt uitgedrukt met een symbool RF. RF. waarde wordt gebruikt voor kwalitatieve beschrijving van de moleculen [17].

Gaschromatografie

Bij deze methode is de stationaire fase een kolom die in de inrichting wordt geplaatst en een vloeibare stationaire fase bevat die op het oppervlak van een inerte vaste stof wordt geadsorbeerd. Gaschromatografie is een 'gas-vloeistof'-chromatografie. De dragerfase bestaat uit gassen als He of N2. Mobiele fase die een inert gas is, wordt onder hoge druk door een kolom geleid. Het te analyseren monster wordt verdampt en gaat in een gasvormige mobiele fasefase. De componenten in het monster zijn gedispergeerd tussen de mobiele fase en de stationaire fase op de vaste drager. Gaschromatografie is een eenvoudige, veelzijdige, zeer gevoelige en snel toepasbare techniek voor de buitengewoon uitstekende scheiding van zeer kleine moleculen. Het wordt gebruikt bij de scheiding van zeer kleine hoeveelheden analyten [18].

Kleurstof-ligand chromatografie

De ontwikkeling van deze techniek was gebaseerd op het aantonen van het vermogen van veel enzymen om purinenucleotiden voor Cibacron Blue F3GA-kleurstof te binden [19]. De vlakke ringstructuur met negatief geladen groepen is analoog aan de structuur van NAD. Deze analogie is bewezen door het aantonen van de binding van Cibacron Blue F3GA-kleurstof aan adenine, ribose-bindingsplaatsen van NAD. De kleurstof gedraagt ​​zich als een analoog van ADP-ribose. Het bindingsvermogen van dit type adsorbentia is 10 keer sterker dan de affiniteit van andere adsorbentia. Onder geschikte pH-omstandigheden, elutie met oplossingen met een hoge ionsterkte en met behulp van de ionenuitwisselingseigenschap van het adsorbens, worden de geadsorbeerde eiwitten van de kolom gescheiden [20, 21].

Hydrofobe interactiechromatografie (HIC)

Bij deze methode worden de adsorbentia gebruikt die zijn bereid als kolommateriaal voor de ligandbinding in affiniteitschromatografie. De HIC-techniek is gebaseerd op hydrofobe interacties tussen zijketens gebonden aan de chromatografiematrix [22, 23].

Pseudo-affiniteitschromatografie

Sommige verbindingen als antrachinonkleurstoffen en azokleurstoffen kunnen als liganden worden gebruikt vanwege hun affiniteit, vooral voor dehydrogenasen, kinasen, transferasen en reductasen. Het meest bekende type van dit soort chromatografie is geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC) [24].

Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)

Met behulp van deze chromatografietechniek is het mogelijk om in korte tijd structurele en functionele analyse en zuivering van veel moleculen uit te voeren. Deze techniek levert perfecte resultaten op bij de scheiding en identificatie van aminozuren, koolhydraten, lipiden, nucleïnezuren, eiwitten, steroïden , en andere biologisch actieve moleculen. Bij HPLC passeert de mobiele fase door kolommen onder 10� atmosferische druk en met een hoge stroomsnelheid (0,1𠄵 cm//sec). Bij deze techniek verhoogt het gebruik van kleine deeltjes en het toepassen van hoge druk op de snelheid van de oplosmiddelstroom het scheidingsvermogen van HPLC en is de analyse binnen korte tijd voltooid.

Essentiële componenten van een HPLC-apparaat zijn oplosmiddeldepot, hogedrukpomp, commercieel vervaardigde kolom, detector en recorder. Met behulp van een geautomatiseerd systeem wordt de duur van de scheiding gecontroleerd en wordt materiaal opgebouwd [25].

Toepassingsgebieden van chromatografie in de geneeskunde

Chromatografietechniek is een waardevol hulpmiddel voor biochemici, bovendien kan het gemakkelijk worden toegepast tijdens onderzoeken in klinische laboratoria. Papierchromatografie wordt bijvoorbeeld gebruikt om bepaalde soorten suiker en aminozuren in lichaamsvloeistoffen te bepalen die verband houden met erfelijke stofwisselingsstoornissen. Gaschromatografie wordt in laboratoria gebruikt om steroïden, barbituraten en lipiden te meten. Chromatografische techniek wordt ook gebruikt bij de scheiding van vitamines en eiwitten.

Conclusie

Aanvankelijk werden chromatografische technieken gebruikt om stoffen te scheiden op basis van hun kleur, zoals het geval was met kruidenpigmenten. Na verloop van tijd werd het toepassingsgebied aanzienlijk uitgebreid. Tegenwoordig wordt chromatografie geaccepteerd als een uiterst gevoelige en effectieve scheidingsmethode. Kolomchromatografie is een van de bruikbare scheidings- en bepalingsmethoden. Kolomchromatografie is een eiwitzuiveringsmethode die speciaal wordt gerealiseerd op basis van een van de kenmerkende eigenschappen van eiwitten. Bovendien worden deze methoden gebruikt om de zuiverheid van een eiwit te controleren. HPLC-techniek die veel superieure eigenschappen heeft, waaronder vooral de hogere gevoeligheid, snelle omloopsnelheid, het gebruik ervan als kwantitatieve methode, kan aminozuren, eiwitten, nucleïnezuren, koolwaterstoffen, koolhydraten, medicijnen, antibiotica en steroïden zuiveren.


Sterke of zwakke ionenwisselaars

tafel 3 toont de functionele groepen die op IEX-media worden gebruikt. De termen sterk en zwak verwijzen naar de mate waarin de ionisatietoestand van de functionele groepen varieert met de pH. De termen sterk en zwak verwijzen niet naar de sterkte waarmee de functionele groepen aan eiwitten binden.

Begin met een sterke wisselaar om ontwikkelingswerk mogelijk te maken over een breed pH-bereik. Gebruik een sterke anionenwisselaar (Q) om de eiwitten van belang te binden als hun iso-elektrisch punt lager is dan pH 7,0 of onbekend is.

Gebruik een sterke wisselaar in die gevallen waar maximale resolutie optreedt bij een extreme pH en de eiwitten van belang stabiel zijn bij die pH.

Overweeg het gebruik van een zwakke wisselaar als de selectiviteit van de sterke ionenwisselaar onvoldoende is, maar denk eraan dat de ionenuitwisselingscapaciteit van een zwakke ionenwisselaar varieert met de pH. Als resultaat:

  • De capaciteit van de monsterbelading (binding) kan variëren met toenemende pH als gevolg van verlies van lading uit de wisselaar.
  • resolutie wordt gemakkelijker beïnvloed door veranderingen in stroomsnelheid of monsterbelasting vanwege de tussenliggende vormen van ladingsinteractie die kunnen optreden.
  • voorspelde resultaten (gebaseerd op bekende informatie over de monstercomponenten zoals hun iso-elektrische punten en hoe hun netto oppervlaktelading verandert met de pH) correleren mogelijk niet met de werkelijke resultaten, aangezien het aantal geladen groepen op zwakke ionenwisselaars kan variëren met de pH.
  • langere equilibratietijden kunnen nodig zijn om de zwakke functionele groepen voor ionenuitwisseling te titreren.

Als u een zwakke wisselaar gebruikt, werk dan binnen de onderstaande pH-waarden om variaties in prestaties te minimaliseren:


Detector

De taak van de detectoreenheid is het registreren van de tijd en de hoeveelheid van een stof die uit de kolom wordt geëlueerd. De detector neemt de verandering in de samenstelling van het eluens waar en zet deze informatie om in een elektrisch signaal dat met behulp van een computer wordt geëvalueerd. [1] Er is een verscheidenheid aan detectoren beschikbaar, afhankelijk van de structurele kenmerken van de analyt. Gangbare detectoreenheden zijn refractometrische, UV/VIS-, elektrochemische en fluorescentiedetectoren. Fig. 4 toont twee isocratische systeemconfiguraties met verschillende detectoren.


Gebruik van gaschromatografie

GC wordt gebruikt als één test om componenten van een vloeibaar mengsel te helpen identificeren en hun relatieve concentratie te bepalen. Het kan ook worden gebruikt om componenten van een mengsel te scheiden en te zuiveren. Bovendien kan gaschromatografie worden gebruikt om dampdruk, oplossingswarmte en activiteitscoëfficiënten te bepalen. Industrieën gebruiken het vaak om processen te bewaken om te testen op verontreiniging of om ervoor te zorgen dat een proces verloopt zoals gepland. Chromatografie kan bloedalcohol, geneesmiddelzuiverheid, voedselzuiverheid en essentiële oliekwaliteit testen. GC kan worden gebruikt op zowel organische als anorganische analyten, maar het monster moet vluchtig zijn. Idealiter zouden de componenten van een monster verschillende kookpunten moeten hebben.


Gebruik van gaschromatografie

  • Het helpt bij het identificeren van de samenstelling van een vloeibaar mengsel en het achterhalen van de relatieve concentratie.
  • Het helpt bij het scheiden en zuiveren van componenten in een bepaald mengsel.
  • Het wordt gebruikt om de dampdruk, activiteitscoëfficiënten en het hart van de oplossing te achterhalen.
  • Het wordt gebruikt om processen te detecteren om te controleren op besmetting en om ervoor te zorgen dat het proces volgens plan verloopt.
  • Het kan ook worden gebruikt om te controleren op bloedalcohol, voedselzuiverheid, medicijnzuiverheid en kwaliteit van etherische olie. (4, 5 en 6)

Afbeelding 4: De afbeelding hierboven schetst de verschillende componenten van gaschromatografie (diagram).
Afbeeldingsbron:
bitesizebio.com


Berekeningen

Caroteen (geeloranje kleur)
Rf = Afgelegde afstand pigment = 9,0 cm = 0,9375 Afgelegde afstand oplosmiddel 9,6 cm
Xanthofylen (licht geel):
Rf = Afgelegde afstand pigment = 5,7 cm = 0,59375 Afgelegde afstand oplosmiddel 9,6 cm
Chlorofyl A (blauw groen):
Rf = Afgelegde afstand pigment = 3,7 cm = 0,385416 Afgelegde afstand oplosmiddel 9,6 cm
Chlorofyl B (geel groen):
Rf = Afgelegde afstand pigment = 2,5 cm = 0,260416 Afgelegde afstand oplosmiddel 9,6 cm
anthocyaan (rood):
Rf = Afgelegde afstand pigment = 0,6 cm = 0,0625 Afgelegde afstand oplosmiddel 9,6 cm

Hoe werkt high-performance vloeistofchromatografie?

De componenten van een eenvoudig high-performance vloeistofchromatografiesysteem [HPLC] worden weergegeven in het eenvoudige diagram in figuur E.

Een reservoir bevat het oplosmiddel [de mobiele fase genoemd, omdat het beweegt]. Een hogedrukpomp [oplosmiddelafgiftesysteem of oplosmiddelmanager] wordt gebruikt om een ​​gespecificeerde stroomsnelheid van de mobiele fase, typisch milliliter per minuut, te genereren en te doseren. Een injector [monstermanager of autosampler] kan het monster inbrengen [injecteren] in de continu stromende mobiele fasestroom die het monster in de HPLC-kolom voert. De kolom bevat het chromatografische pakkingsmateriaal dat nodig is om de scheiding te bewerkstelligen. Dit verpakkingsmateriaal wordt de stationaire fase genoemd omdat het op zijn plaats wordt gehouden door de kolomhardware. Er is een detector nodig om zien de gescheiden samengestelde banden als ze uit de HPLC-kolom elueren [de meeste verbindingen hebben geen kleur, dus we kunnen ze niet met onze ogen zien]. De mobiele fase verlaat de detector en kan naar wens worden afgevoerd of verzameld. Wanneer de mobiele fase een gescheiden verbindingsband bevat, biedt HPLC de mogelijkheid om deze fractie van het eluaat dat die gezuiverde verbinding bevat te verzamelen voor verder onderzoek. Dit wordt preparatieve chromatografie genoemd [besproken in de sectie over HPLC-schaal].

Merk op dat hogedrukslangen en fittingen worden gebruikt om de pomp-, injector-, kolom- en detectorcomponenten met elkaar te verbinden om de leiding te vormen voor de mobiele fase, het monster en de gescheiden samengestelde banden.

Afbeelding E: High-Performance Liquid Chromatography [HPLC]-systeem

De detector is aangesloten op het computergegevensstation, het HPLC-systeemonderdeel dat het elektrische signaal registreert dat nodig is om het chromatogram op het display te genereren en om de concentratie van de monsterbestanddelen te identificeren en te kwantificeren (zie afbeelding F). Omdat de eigenschappen van de samengestelde monsters heel verschillend kunnen zijn, zijn er verschillende soorten detectoren ontwikkeld. Als een verbinding bijvoorbeeld ultraviolet licht kan absorberen, wordt een UV-absorptiedetector gebruikt. Als de verbinding fluoresceert, wordt een fluorescentiedetector gebruikt. Als de verbinding geen van beide eigenschappen heeft, wordt een meer universeel type detector gebruikt, zoals een verdampingslichtverstrooiingsdetector [ELSD]. De krachtigste aanpak is het gebruik van meerdere detectoren in serie. Er kan bijvoorbeeld een UV- en/of ELSD-detector worden gebruikt in combinatie met een massaspectrometer [MS] om de resultaten van de chromatografische scheiding te analyseren. Dit geeft vanaf een enkele injectie uitgebreidere informatie over een analyt. De praktijk van het koppelen van een massaspectrometer aan een HPLC-systeem wordt LC/MS genoemd.

Afbeelding F: een typisch HPLC [Waters Alliance]-systeem

HPLC-bewerking
Een eenvoudige manier om te begrijpen hoe we de scheiding van de verbindingen in een monster bereiken, is door het diagram in figuur G te bekijken.

Mobiele fase komt de kolom van links binnen, gaat door het deeltjesbed en verlaat rechts. Stroomrichting wordt weergegeven door groene pijlen. Bekijk eerst de bovenste afbeelding, deze vertegenwoordigt de kolom op tijdstip nul [het moment van injectie], wanneer het monster de kolom binnenkomt en een band begint te vormen. Het hier getoonde monster, een mengsel van gele, rode en blauwe kleurstoffen, verschijnt bij de inlaat van de kolom als een enkele zwarte band. [In werkelijkheid zou dit monster alles kunnen zijn dat kan worden opgelost in een oplosmiddel, meestal zouden de verbindingen kleurloos zijn en de kolomwand ondoorzichtig, dus we zouden een detector nodig hebben om de gescheiden verbindingen te zien terwijl ze elueren.]

Na een paar minuten [onderste afbeelding], waarin de mobiele fase continu en gestaag langs de deeltjes van het verpakkingsmateriaal stroomt, kunnen we zien dat de afzonderlijke kleurstoffen met verschillende snelheden in afzonderlijke banden zijn bewogen. Dit komt omdat er een competitie is tussen de mobiele fase en de stationaire fase voor het aantrekken van elk van de kleurstoffen of analyten. Merk op dat de gele kleurstofband het snelst beweegt en op het punt staat de kolom te verlaten. De gele kleurstof houdt meer van [wordt aangetrokken door] de mobiele fase dan de andere kleurstoffen. Daarom beweegt het met een sneller snelheid, dichter bij die van de mobiele fase. De blauwe kleurstofband houdt meer van het verpakkingsmateriaal dan van de mobiele fase. Zijn sterkere aantrekkingskracht op de deeltjes zorgt ervoor dat het aanzienlijk beweegt langzamer. Met andere woorden, het is de meest vastgehouden verbinding in dit monstermengsel. De rode kleurstofband heeft een intermediaire aantrekkingskracht op de mobiele fase en beweegt daarom met een tussenliggend snelheid door de kolom. Omdat elke kleurstofband met verschillende snelheden beweegt, kunnen we deze chromatografisch scheiden.

Afbeelding G: Begrijpen hoe een chromatografische kolom werkt - Bands

Wat is een detector?
Als de gescheiden kleurstofbanden de kolom verlaten, gaan ze onmiddellijk de detector in. De detector bevat een stroomcel die: ziet [detecteert] elke gescheiden samengestelde band tegen een achtergrond van mobiele fase [zie figuur H]. [In werkelijkheid zijn oplossingen van veel verbindingen bij typische HPLC-analytische concentraties kleurloos.] Een geschikte detector kan de aanwezigheid van een verbinding detecteren en het bijbehorende elektrische signaal naar een computergegevensstation sturen. Er wordt een keuze gemaakt uit veel verschillende soorten detectoren, afhankelijk van de kenmerken en concentraties van de verbindingen die moeten worden gescheiden en geanalyseerd, zoals eerder besproken.

Wat is een chromatogram?
Een chromatogram is een weergave van de scheiding die chemisch [chromatografisch] heeft plaatsgevonden in het HPLC-systeem. Op een tijdas wordt een reeks pieken getekend die vanaf een basislijn stijgen. Elke piek vertegenwoordigt de detectorrespons voor een andere verbinding. Het chromatogram wordt uitgezet door het computerdatastation [zie figuur H].

Afbeelding H: Hoe pieken worden gemaakt

In figuur H is de gele band volledig door de detectorstroomcel gegaan, het gegenereerde elektrische signaal is naar het computergegevensstation gestuurd. Het resulterende chromatogram begint op het scherm te verschijnen. Merk op dat het chromatogram begint wanneer het monster voor het eerst werd geïnjecteerd en begint als een rechte lijn aan de onderkant van het scherm. Dit wordt de basislijn genoemd en vertegenwoordigt de pure mobiele fase die in de loop van de tijd door de stroomcel gaat. Terwijl de gele analytband door de stroomcel gaat, wordt een sterker signaal naar de computer gestuurd. De lijn buigt eerst naar boven en vervolgens naar beneden, in verhouding tot de concentratie van de gele kleurstof in de monsterband. Hierdoor ontstaat een piek in het chromatogram. Nadat de gele band volledig uit de detectorcel is gepasseerd, keert het signaalniveau terug naar de basislijn, de stroomcel heeft nu opnieuw alleen pure mobiele fase erin. Omdat de gele band het snelst beweegt en als eerste uit de kolom wordt geëlueerd, is dit de eerste piek die wordt getrokken.

Even later bereikt de rode band de stroomcel. Het signaal stijgt op vanaf de basislijn als de rode band voor het eerst de cel binnenkomt, en de piek die de rode band vertegenwoordigt begint te worden getekend. In dit diagram is de rode band niet volledig door de stroomcel gegaan. Het diagram laat zien hoe de rode band en rode piek eruit zouden zien als we het proces op dit moment zouden stoppen. Aangezien het grootste deel van de rode band door de cel is gegaan, is het grootste deel van de piek getekend, zoals weergegeven door de ononderbroken lijn. Als we zouden kunnen herstarten, zou de rode band volledig door de stroomcel gaan en zou de rode piek voltooid zijn [stippellijn]. De blauwe band, die het sterkst wordt vastgehouden, reist met de laagste snelheid en elueert na de rode band. De stippellijn laat zien hoe het voltooide chromatogram eruit zou zien als we de run tot het einde hadden laten doorgaan. Het is interessant om op te merken dat de breedte van de blauwe piek het breedst zal zijn omdat de breedte van de blauwe analytband, hoewel het smalst op de kolom, het breedst wordt wanneer deze uit de kolom elueert. Dit komt omdat het langzamer door het bed van het chromatografische verpakkingsmateriaal beweegt en meer tijd [en volume van de mobiele fase] nodig heeft om volledig te worden geëlueerd. Aangezien de mobiele fase continu met een vaste snelheid stroomt, betekent dit dat de blauwe band breder en dunner wordt. Omdat de detector reageert in verhouding tot de concentratie van de band, is de blauwe piek lager in hoogte, maar groter in breedte.