Informatie

Optimale overlaplengte van de gibsonmontage


Weet iemand de optimale lengte van overlap die uw primers moeten hebben voor uw vector voor gibson-assemblage. De meeste fabrikanten zeggen aan beide kanten minimaal 20 bp te doen, maar geven geen maximum. Soms voeg ik aan beide 30-35 bp toe. Ik weet niet of dat de efficiëntie in de weg staat.


Intro

Deze tutorial is een samenvoeging van de lessen/tips/trucs die ik heb geleerd tijdens het gebruik van Gibson-klonen voor tientallen verschillende kloonprojecten. Het is bedoeld om de beschikbare protocollen aan te vullen met wat advies en waarschuwingen waarvan ik hoop dat ze u tijd kunnen besparen met uw assemblages.

  • Gibson-assemblage zorgt voor naadloos klonen, vrij gemakkelijk.
  • Assemblages zijn onafhankelijk van de volgorde en u bent niet beperkt tot het gebruik van restrictie-enzym-cut-sites.
  • Assemblages zijn zonder littekens.
  • U kunt meerdere stukken samenstellen uit meerdere DNA-bronnen (plasmiden, genomen, enz.)
  • Het kan worden gebruikt voor plaatsgerichte mutagenese: NEB-gids
  • De efficiëntie neemt af naarmate de assemblage groter wordt (>8 kb begint een probleem te worden) en naarmate het aantal stuks toeneemt (3-4 is ok, maar ik heb niet meer geprobeerd). Het is ook lager bij het klonen van toxische genen.
  1. Ontwerp oligo's om 20 - 100 bp overlappende lineaire DNA-segmenten op te leveren
  2. Schone DNA-fragmenten (kolomopruiming of gel indien nodig)
  3. Gebruik Gibson Assembly Mix (nu in de handel verkrijgbaar)
  4. Transformeren
    1. Elektroporatie wordt meestal gebruikt om een ​​hogere opbrengst te verkrijgen.

    Voor een grondige bespreking van de constructie van primers voor gebruik in Gibson Assembly, zie de volgende publicatie: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21601685.

    Een opmerking over het ontwerp van de primer = Probeer uw kruispunten zo te ontwerpen dat ze tussen de oorsprong van replicatie of de selecteerbare marker op het plasmide dat u wilt maken, liggen. Dit zal uw aantal fout-positieven verminderen.


    Optimale overlaplengte van de gibson-assemblage - Biologie

    De tool ontwerpt primers met een lengte van 60 nucleotiden (nt). Elke primer bevat 20 nt genspecifieke sequentie voor template-annealing en 30-40 nt overlapsequentie, die zal worden gebruikt om homologe overlap tussen twee aangrenzende fragmenten te genereren.

    40 bp homologe sequenties

    De Gibson Assembly® Primer Design Tool genereert primers die worden gebruikt voor het toevoegen van homologe overlappingen aan fragmenten, wat een efficiënte montage mogelijk maakt. Primers zijn gefixeerd op een lengte van 60 nucleotiden en omvatten 20 nucleotiden van een genspecifieke sequentie voor template-annealing. Tussen de vector en de insertieovergang kunt u een sequentiemotief opnemen, tot 10 nt lang, om restrictiedigestie mogelijk te maken. Als resultaat kan een homologe overlap van 30 tot 40 bp worden gegenereerd na PCR-amplificatie. De grootte van de overlap is voldoende om één fragmentassemblage tot 10 kb te ondersteunen, of tot 15 fragmenten met inserts tot 1 kb elk. Het verlengen van de homologe overlap wordt aanbevolen voor de assemblage van grote genen.


    DNA-assemblage en klonen in een nachtelijke run met het BioXp ™ 3200-systeem

    Het BioXp ™ 3200-systeem is een geautomatiseerd persoonlijk genomisch werkstation dat DNA-fragmenten bouwt en kloneert in een proces dat vrijwel handsfree is. In een nachtelijke run genereert het instrument gekloond DNA uit op maat ontworpen oligonucleotidepools en reagentia die zijn ontwikkeld op basis van sequentie-informatie. Hier bespreken we hoogtepunten en voordelen van het BioXp-systeem en de twee modules die momenteel beschikbaar zijn, de assemblagemodule en de assemblage-en-klonenmodule.

    Aangezien de schaal van genetische analyse is verschoven van enkelvoudige genstudies naar genfamilie-, genomische en metagenomische studies, is de vraag naar grootschalige DNA-synthesediensten en -technologieën gegroeid. Bovendien versnelt het tempo van moleculair biologisch onderzoek met nieuwere klonen en sequencing-technologieën. Synthetic Genomics, Inc. heeft het BioXp-systeem (Fig. 1) ontwikkeld, dat beschikbaar is via SGI-DNA, als een intern laboratoriuminstrument om tegemoet te komen aan de toegenomen belangstelling en vraag naar snelle DNA-synthese. Met een assemblagemodule genereert het BioXp-systeem lineaire DNA-fragmenten van hoge kwaliteit uit op maat ontworpen oligonucleotidepools en reagentia over een zinvol deel van het complexiteitscontinuüm in een nachtelijke run. Nu, met de introductie van de module voor assemblage en klonering, heeft het BioXp-systeem de extra mogelijkheid om gekloneerd DNA van een aangepaste DNA-sequentie af te leveren in een nachtelijke run (Fig. 2).

    Het BioXp 3200-systeem, een genomisch werkstation.

    De montagemodule levert lineaire DNA-fragmenten. De module voor assemblage en klonering levert DNA dat is gekloond in een plasmidevector. Beide modules bouwen DNA op in een nachtelijke run.

    Sinds de lancering begin 2015 profiteren commerciële en onderzoekslaboratoria van de voordelen van het BioXp-systeem, zowel in individuele laboratoria als in kernfaciliteiten. On-site toegang tot het geautomatiseerde BioXp-systeem bevrijdt onderzoekers van de tijdrovende, vervelende stappen die nodig zijn om DNA-fragmenten te verkrijgen, waardoor ze zich in plaats daarvan kunnen concentreren op nieuwe ontdekkingen en DNA-analyses.

    De BioXp-module voor assemblage en klonen

    Met de assemblagemodule bouwt het BioXp-systeem lineaire, stompe, dubbelstrengs DNA-fragmenten. Nu, met de module voor assembleren en klonen, heeft het instrument de extra mogelijkheid om interessante DNA-fragmenten te bouwen en te klonen in de SGI-DNA pUCGA 1.0-vector. De pUCGA 1.0-klonen gegenereerd door het BioXp-systeem zijn onmiddellijk klaar voor transformatie en verdere stroomafwaartse analyse.

    BioXp-systeem pUCGA 1.0-klonen

    DNA-klonen die zijn verkregen uit het BioXp-systeem, bestaan ​​uit een interessant DNA-fragment (400-1.800 bp, 40-60% GC-gehalte) dat is gekloond in de pUCGA 1.0-vector van 2,7 kb. De vectorkaart pUCGA 1.0 en aanvullende informatie zijn beschikbaar op http://sgidna.com. Met Gibson Assembly®-technologie worden homologe overlappende gebieden automatisch ontworpen in de uiteinden van de DNA-fragmenten en zijn aanwezig in de pUCGA 1.0-vector om klonen te vergemakkelijken. Deze homologe regio's, GA-uiteinden genoemd, bestaan ​​uit 30 basen die een minimale sequentiehomologie hebben met natuurlijk voorkomende genen. Zeer nauwkeurig en robuust geautomatiseerd klonen op het BioXp-systeem wordt uitgevoerd met behulp van de Gibson-assemblagemethode (Fig. 3a). Klonen verkregen uit het BioXp-systeem zijn klaar voor transformatie en daaropvolgende stroomafwaartse analyse.

    (een) Overzicht van Gibson Assembly-klonering op het BioXp 3200-systeem met een BioXp-fragment en de pUCGA 1.0-vector. (B) Hoge kloneringsefficiëntie van het BioXp 3200-systeem. Zoals verwacht werden de hoogste kloneringsefficiënties bereikt met de kleinste DNA-fragmenten. De totale kloneringsefficiëntie (CE) voor inserts van volledige lengte werd berekend met behulp van de volgende formule: CE (%) = (Aantal witte kolonies/totaal aantal kolonies) × (Aantal volledige insertkolonies/totaal aantal kolonies) × 100 Het monsternummer (N) wordt boven elke respectieve balk weergegeven, foutbalken vertegenwoordigen ±s.d.

    Transformeren van pUCGA 1.0-klonen

    Zodra klonen zijn verzameld van het BioXp-systeemdek na een assemblage- en kloonrun, is transformatie de volgende stroomafwaartse stap die nodig is voor foutloze kloonidentificatie en verdere analyse. De pUCGA 1.0-vector bevat lacZ (het gen dat codeert voor het N-terminale fragment van β-galactosidase), dat wordt verstoord door insertie van het BioXp-DNA-fragment, waardoor een blauw-witte screening van recombinante klonen mogelijk wordt. Om de kloonkwaliteit te beoordelen, voerden we transformatie uit en berekenden we de kloneringsefficiëntie van pUCGA 1.0-klonen. In het kort werd een assemblage- en kloneringsrun 13 keer herhaald op vijf verschillende BioXp-instrumenten. Twintig klonen werden na elke run willekeurig uit de instrumenten verzameld, getransformeerd in TransforMax™ EPI300™ elektrocompetente Escherichia colien uitgeplaat op LB-platen die 100 g ml −1 carbenicilline met 40 μg ml −1 X-Gal en 0,1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside bevatten. Na een incubatie overnacht werden kolonies geteld, geplukt en overnacht gekweekt, en werd plasmide-DNA bereid.

    Hoge kloneringsefficiëntie van pUCGA 1.0-klonen

    De kloneringsefficiëntie van constructies die zijn gegenereerd met de BioXp-module voor assemblage en klonen wordt weergegeven in figuur 3b. De algehele kloneringsefficiëntie van pUCGA 1.0-klonen van volledige lengte was 83%. Bovendien hebben we klonen gegroepeerd op fragmentgrootte voor verdere analyse van de efficiëntie van het klonen. Zoals verwacht werd de hoogste kloneringsefficiëntie (>90%) waargenomen voor de kleinste DNA-fragmenten (<900 bp).

    Inserts van volledige lengte werden geïdentificeerd uit dubbele enzymdigestie met XbaI en BglII (Fig. 3a), die een gedeeltelijke of volledige GA-eindsequentie intact laat aan het uiteinde van het BioXp-fragment. Voor excisie van alleen het fragment van belang uit pUCGA 1.0, kan het BioXp-fragment vooraf worden ontworpen met restrictie-enzymplaatsen aan de binnenkant van de GA-uiteinden. Als alternatief kan PCR-amplificatie met een high-fidelity DNA-polymerase worden gebruikt om het fragment van belang te isoleren of om het fragment in een alternatieve vector (bijvoorbeeld een expressievector) te subkloneren.

    Het BioXp-systeem brengt een nieuwe, snelle, geautomatiseerde methode voor DNA-synthese en klonering rechtstreeks naar de laboratoriumtafel. Het instrument kan momenteel 24 DNA-fragmenten van belang gelijktijdig assembleren en klonen in een nachtelijke run. De DNA-klonen van pUCGA 1.0 die zijn verkregen uit het BioXp-systeem vertonen een hoge kloneringsefficiëntie - meer dan 90% voor DNA-fragmenten met een lengte van minder dan 900 bp en in totaal 83%. Laboratoria die het BioXp-systeem gebruiken, kunnen in een nachtelijke run vrijwel handsfree genen in vectoren assembleren en klonen.


    Abstract

    Moderne kloneringsmethoden zijn onafhankelijk van restrictie-enzymherkenningsplaatsen. Bijna alle huidige kloneringsmethoden vereisen echter nog steeds de introductie van overlappingen door PCR, die ongewenste mutaties kunnen introduceren. Hier hebben we onderzocht of overlappingen die nodig zijn voor DNA-assemblage kunnen worden gesynthetiseerd ter plaatse en we hebben getest of de de novo synthese van sequenties kan gelijktijdig worden gecombineerd met de assemblage van grotere dubbelstrengs DNA-fragmenten. We hebben in een set van 44 kloneringsexperimenten aangetoond dat overlappingen van 20 bp die nodig zijn voor DNA-assemblage kunnen worden gesynthetiseerd ter plaatse van enkelstrengs oligonucleotiden. Korte sequenties van 30-255 bp kunnen worden gesynthetiseerd uit enkelstrengs oligonucleotiden gelijktijdig met DNA-assemblage, en beide technieken kunnen worden gecombineerd. De assemblage van vergelijkbare constructies met behulp van de modernste technieken zou meerdere klonen of vervelende monstervoorbereidingen vereisen, terwijl onze aanpak een eenstapsreactie is.


    Optimale overlaplengte van de gibson-assemblage - Biologie

    15 bps) dan algemeen aanbevolen voor SLIC/Gibson/CPEC/SLiCE (

    25 bps), kan het toepassen van de SLIC/Gibson/CPEC/SLiCE-methoden op DNA-fragmenten die zijn geoptimaliseerd voor GeneArt® Seamless Cloning mogelijk niet succesvol zijn. Zoals beschreven in het stapsgewijze voorbeeld van SLIC/Gibson/CPEC, is het noodzakelijk om de j5-ontwerpparameters aan te passen om assemblages voor GeneArt® Seamless Cloning te optimaliseren. Zie voor meer informatie de GeneArt® Seamless Cloning-documentatie op de Life Technologies-website.

    In-Fusion® klonen

    In-Fusion® Cloning is een gepatenteerde assemblagemethode die is ontwikkeld door Clontech. Deze assemblagemethode gebruikt dezelfde typen DNA-uitgangsmaterialen als die voor SLIC/Gibson/CPEC/SLiCE (hierboven beschreven) en resulteert in hetzelfde eindproduct. Een belangrijk verschil is dat de aanbevolen overlaplengte slechts 15 bps is (zoals GeneArt® Seamless Cloning, hierboven beschreven, behalve dat het werkt bij 50 °176C zoals Gibson), wat voordelig kan zijn ten opzichte van SLIC/Gibson/CPEC/SLiCE vanuit het standpunt van het vereisen van kortere/goedkopere DNA-oligo's en het mogelijk maken van combinatorische assemblageontwerpen met sequentiediversiteit dicht bij de uiteinden van de te assembleren sequentiefragmenten. Aan de andere kant kan een kortere overlaplengte de assemblagespecificiteit verminderen, en afhankelijk van het assemblagemechanisme (eigendom), kan een hoge zelfcomplementariteit of een sterke enkelstrengs secundaire DNA-structuur in het overlapgebied problematischer zijn dan voor SLIC/Gibson/CPEC/ Plak. Omdat de overlaplengte korter is (


    Resultaten en discussie

    Gelijktijdige assemblage van één dsDNA-fragment en de De Novo Synthese van een extra reeks

    Onze eerste taak was om een ​​set constructies samen te stellen waarin een gen van belang werd gefuseerd met een doelsequentie aan het begin van het gen. De grootte van de fusie (3� bp) maakte het echter moeilijk om deze sequenties in een primer voor PCR-amplificatie te introduceren. Daarom hebben we getest of de gelijktijdige de novo synthese van een sequentie en assemblage van het gen van belang is mogelijk met isotherme assemblage in één stap. 3,4 In de stand van de techniek kunnen deze methoden worden gebruikt om meerdere overlappende dsDNA-moleculen te assembleren of, als alternatief, om de novo DNA-moleculen van overlappende oligonucleotiden. De combinatie van beide in een eenstapsreactie is nog niet beschreven.

    We hebben deze benadering getest door 47 constructen te klonen die zes verschillende promotors, vier verschillende N-terminale fusies en vijf genen combineren (ondersteunende informatie figuur 1). Van de 120 theoretisch mogelijke constructies kozen we er 47 voor klonering. De bibliotheek van 47 constructen werd geassembleerd in een miniTn4001-Puro-1-backbone (GenBank-toegangsnummer <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"KC816623","term_id":"590309357 ","term_text":"KC816623">> KC816623). De constructen bestonden uit een PCR-insert (dsDNA tussen 500 en 2700 bp) en a de novo sequentie (tussen 30 en 255 bp). Deze de novo sequenties werden opgebouwd uit combinaties van twee tot acht oligonucleotiden van ongeveer 60 bp met een overlap van 20 bp. Voor het volledige experiment werden 77 oligonucleotiden gebruikt (ondersteunende informatietabel 2). De de novo sequentie bevatte de promotor en een korte sequentie die zou moeten worden gefuseerd met het PCR-insert. In de eerste kloneringsronde kregen we 29 van de 47 constructen met de juiste sequentie. Na nog twee ronden van transformatie en screening verkregen we 42 van de 47 constructen (ondersteunende informatietabel 1). We hergebruikten de initiële assemblagereactie voor de tweede en derde ronde van transformatie en koloniescreening. Twee van de vier constructen met zeven oligonucleotiden werden niet met de juiste sequentie verkregen, hoewel beide constructen met acht oligonucleotiden met de juiste sequentie werden verkregen. We observeerden achtergrond in de transformatie, deels vanwege recircularisatie van de vector (32% van alle kolonies) en het genereren van een onbekend product tijdens het assemblageproces (29% van alle kolonies). Het onbekende product is een gevolg van de instabiliteit van de vector-backbone (minitransposon-vector) en werd ook gedetecteerd tijdens conventionele klonering met deze vector. Desalniettemin maakte deze strategie een gemakkelijke assemblage van constructies in één pot mogelijk die op een andere manier moeilijk te bereiden zou zijn. We evalueerden kolonie-PCR-hits en foutenpercentages in detail voor de constructen die werden verkregen in de derde ronde van de transformatie (tabel 1). Om de transformatie-efficiëntie voor deze constructen te verhogen, werden de reactiemengsels van de assemblage vóór transformatie gezuiverd door MinElute-kolommen. Twaalf kolonies voor elk construct werden gescreend, met een trefferpercentage van 63% in de kolonie-PCR. Het totale hitpercentage was echter slechts 40,5%, deels vanwege de problematische ruggengraat. Voor elk construct selecteerden we vier kolonies die een hit vertoonden in de kolonie-PCR, en we bepaalden de sequentie van het construct. Gemiddeld kregen we een correcte sequentie voor 50% van de klonen. De individuele percentages voor elk construct varieerden echter van 25 tot 100% correcte sequenties. Als algemene trend bevatten langere gesynthetiseerde stukken meer fouten. Dit is niet verrassend omdat de synthese van oligonucleotiden foutgevoelig is en de fouten accumuleren met een toenemend aantal oligonucleotiden dat voor een construct wordt gebruikt. De waargenomen fouten waren 14 inserties, vijf mutaties en twee deleties waren allemaal gelokaliseerd in het deel dat werd gesynthetiseerd door oligonucleotiden. Bij de screening van de volledige bibliotheek werd slechts één truncatie en één mutatie gedetecteerd in de delen die werden geïntroduceerd als dsDNA-PCR-producten.

    Tafel 1

    construerenhit rate kolonie PCR (%)sequentieresultaat gemuteerd/mislukt/correctcorrecte klonen (%)DNA synthese lengtetotaal aantal foutenfout per bpinvoegingen/verwijderingen/mutaties
    1358.333/0/125.008750.0574/1/0
    1541.672/0/250.0011420.0172/0/0
    2283.331/0/375.009620.0202/0/0
    1966.671/1/250.006910.0141/0/0
    3066.672/0/250.009630.0311/0/2
    3183.333/0/125.009650.0523/0/2
    3641.670/0/4100.0046000/0/0
    4675.001/0/375.007310.0130/0/1
    4158.332/1/125.005290.1731/8/0
    totaal6315/2/1952729210.0314/2/5

    Ter plaatse Generatie van overlappingen van oligonucleotiden

    Na te hebben waargenomen dat sequentiesynthese van oligonucleotiden en DNA-assemblage gelijktijdig kan worden gedaan met behulp van een eenstaps isotherme assemblage-mastermix, hebben we onderzocht of de overlappingen die nodig zijn voor assemblage gelijktijdig konden worden toegevoegd ter plaatse.

    Om de overlappingen te synthetiseren die nodig zijn voor de enzymatische assemblage ter plaatse, hebben we vier verschillende oligonucleotiden toegevoegd aan de enzymatische assemblagemix. Elke oligonucleotide overlapt 20 bp met de insert (de bla gen inclusief de promotor, PCR geamplificeerd vanaf pJET 1.2, GenBank toegangsnr. <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EF694056.1","term_id":"149999561","term_text":"EF694056.1">> EF694056.1, werd gebruikt als sjabloon) en 20 bp met de gelineariseerde vector pETM14 5 (Figuur ​ (Figuur 1a) 1 a) (GenBank toegangsnummer <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":" KC816624","term_id":"590309379","term_text":"KC816624">> KC816624). Na het transformeren van Top 10 E coli competente cellen met 1 μL van het assemblagemengsel, werden gemiddeld 748 positieve kolonies verkregen.

    (a) Schematische weergave van de oligonucleotiden die worden gebruikt voor de ter plaatse overlappingen genereren. De oligonucleotiden worden getoond met betrekking tot de geassembleerde dsDNA-fragmenten. De balk geeft de grootte van de oligonucleotiden aan (ze zijn niet op schaal met de overlappende gebieden). (b) Effect van oligonucleotideconcentratie op het aantal verkregen kolonies na transformatie evenals het percentage verkregen positieve kolonies. (c) Aantal verkregen kolonies afhankelijk van verschillende combinaties van oligonucleotiden evenals het percentage positieve kolonies. Het percentage positieve kolonies werd bepaald door het aantal kolonies op een plaat met ampicilline (AMP) te delen door het aantal kolonies op een plaat met kanamycine (KAN). De oligonucleotidenummers komen overeen met die in paneel a.

    We plaatsten getransformeerde cellen op agarplaten die ofwel ampicilline of kanamycine als selectief middel bevatten. Hierdoor konden we onderscheid maken tussen achtergrondkolonies en kolonies die onze insert bevatten op wereldwijde schaal zonder de noodzaak om kolonie-PCR te gebruiken. We hebben vastgesteld dat twee oligonucleotiden voldoende kunnen zijn voor de assemblage (Figuur ​ (Figuur 1c), 1c), en het blijkt dat oligonucleotide 2 essentieel is voor assemblage, terwijl oligonucleotiden 3 en 4 uitwisselbaar zijn. We hebben hier geen verklaring voor en we hebben bij andere gelegenheden verschillende afhankelijkheden waargenomen (gegevens niet getoond). We veronderstellen dat eigenschappen van de individuele oligonucleotidesequentie, synthese of preparaten de bepalende factor zijn. Daarom raden we aan om als standaardprocedure alle vier oligonucleotiden te gebruiken, omdat dit de meest robuuste voorwaarde biedt voor de succesvolle montage van het construct. De optimale concentratie van oligonucleotiden in de uiteindelijke mastermix was ongeveer 45 nM (Figuur ​ (Figuur 1b). 1b). Zeer hoge concentraties oligonucleotiden (<0003e150 nM) remden de DNA-assemblagestap en verminderden de efficiëntie van de transformatie. Over het algemeen hebben we aangetoond dat het mogelijk is om ter plaatse synthetiseer overlappingen in een eenstaps isotherme assemblagereactie, en we vonden robuuste parameters voor deze assemblage. Dit vergemakkelijkt de high-throughput klonering van hetzelfde fragment in veel niet-standaard vectoren door alleen de stitching-oligonucleotiden uit te wisselen.

    We hebben waargenomen dat isotherme assemblagemengsels die alleen de gelineariseerde vector bevatten significante hoeveelheden kolonies opleverden, terwijl de gelineariseerde vector zonder isotherme assemblage of in de afwezigheid van Taq-ligase geen kolonies opleverde. We verkregen dezelfde resultaten met een commerciële versie van het isotherme assemblagemengsel verkregen van NEB in combinatie met een commerciële gelineariseerde vector die een dood-gen bevat (pJET 1.2). De gerecirculariseerde assemblageproducten zijn afgeknotte versies van de oorspronkelijke vector en niet een eenvoudige religatie van de gelineariseerde vector. Dit is bij velen in het veld bekend. Het vormt geen probleem bij standaard kloneringstoepassingen omdat het percentage positieve klonen in een normale samenstelling bijna 90% is. De achtergrond wordt alleen waargenomen wanneer de assemblage faalt of in de negatieve controle van de vector. Dit is een nadeel wanneer de montageomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd tegen een negatieve controle. Daarom raden we aan om de assemblageomstandigheden te optimaliseren met behulp van een antibioticumresistentiegen als insert of om een ​​koloniescreeningschema met voldoende doorvoer te plannen.

    Montage van twee inzetstukken door: in situ Generatie van overlappingen en De Novo Montage van een promotor en RBS (156 bp)

    Na te hebben aangetoond dat de ter plaatse synthese van overlappingen van oligonucleotiden mogelijk is en dat het kan worden gecombineerd met de assemblage van dsDNA-fragmenten, we hebben getest of het mogelijk is om de twee methoden te combineren en meerdere fragmenten te klonen (Figuur ​ (Figuur 2). 2). Hiervoor hebben we ervoor gekozen om de importin-α (1,6 kb) en importin-β (2,6 kb) genen in de pCDF-Duet-vector te klonen, terwijl we een spacer van 156 bp daartussen bouwen, bestaande uit een T7-promoter en gemodificeerde RBS (GenBank-toegangsnummer <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"KC816625","term_id":"590309400","term_text":"KC816625">> KC816625). Om dit te bereiken werden drie verschillende oligonucleotideconcentraties getest in de uiteindelijke mastermix: 550, 55 en 5,5 nM. Als negatieve controles gebruikten we een eenstaps isotherme assemblage-mastermix zonder Taq-ligase en een complete mastermix die de oligonucleotiden mist (ondersteunende informatietabel 4). We screenden 12 kolonies van de assemblagemix met 55 nM oligonucleotiden op de aanwezigheid van beide inserts, en we vonden acht kolonies met een PCR-signaal voor importin-α en vier kolonies voor importin-β. Drie van de kolonies waren positief voor beide inserts. De plasmide-DNA's van de dubbel-positieve klonen werden gezuiverd en er werden geen fouten gedetecteerd na sequentiebepaling.

    Schematische workflow en oligonucleotide-ontwerp. (a) Algemene werkstroom. dsDNA-fragmenten en een gelineariseerde vector worden verkregen. Vervolgens worden de fragmenten, de vector en de oligonucleotiden toegevoegd aan de eenstaps isotherme assemblage-mastermix. (b) Distributie van de oligonucleotiden op het construct voor de assemblage van importine-α (1,6 kb) en importine-β (2,6 kb) genen in de pCDF-Duet-vector. Daartussen werd een spacer van 156 bp gesynthetiseerd, die was samengesteld uit een T7-promoter en een gemodificeerde RBS. De overlap tussen de afzonderlijke oligonucleotiden en de vector- en DNA-fragmenten is 20 bp.

    We verkregen 26 kolonies in de assemblage van de negatieve controle zonder oligonucleotiden en 10 in de negatieve controle zonder ligase. Sequentieresultaten toonden aan dat de achtergrond het resultaat is van een verkeerd geprimed product van de PCR-linearisatie van de ruggengraat. Dit product produceerde twee homologe uiteinden die tijdens de reactie konden combineren. Dergelijke bijproducten kunnen gemakkelijk worden geëlimineerd door PCR-screening en hebben geen invloed op het algehele gemak van deze methode.

    We hebben aangetoond dat de synthese van sequenties van enkelstrengs oligonucleotiden kan worden gecombineerd met de assemblage van DNA-fragmenten tot een vector. We hebben ook aangetoond dat de overlappingen die nodig zijn voor DNA-assemblage kunnen worden gesynthetiseerd ter plaatse tijdens de montage. Door deze twee benaderingen te combineren, konden we, in een eenstapsreactie, twee genen samenvoegen die a de novo opgebouwde volgorde.

    Deze techniek is ook voordelig voor individuele constructies wanneer: de novo er moeten sequenties worden geconstrueerd die te groot zijn om in een primer te worden geïntroduceerd. Met onze techniek kan bijvoorbeeld een secretiesignaal van 30 aminozuren of meer gemakkelijk worden gesynthetiseerd in een kloneringsreactie in één stap. Door alleen individuele oligonucleotiden uit te wisselen, kunnen mutaties in de aminozuursequentie worden geïntroduceerd om hun effect op het fenotype te onderzoeken.

    De ter plaatse synthese van overlappingen heeft meerdere toepassingen. Ten eerste kan het worden gebruikt om dsDNA-fragmenten te subkloneren met de veelzijdigheid van isotherme assemblage in één stap, zonder dat er een PCR-reactie nodig is. Een andere toepassing is het genereren van bibliotheken voor expressiescreening waarbij twee genen in veel vectoren moeten worden gekloond terwijl de volgorde van de genen, de promotors en geoptimaliseerde RBS-sites worden gevarieerd. De volgorde van de genen kan eenvoudig worden gewijzigd in de ter plaatse assemblage van de overlappingen door alleen de overlappende oligonucleotiden uit te wisselen. Op dezelfde manier kan een reeks RBS-sites worden gescreend of kunnen nieuwe promotors worden getest. Vergeleken met een standaardklonering worden de voordelen van deze techniek groter naarmate het aantal monsters toeneemt, omdat oligonucleotiden tussen constructen opnieuw kunnen worden gebruikt. De constructie van combinatorische bibliotheken met behulp van het isotherme assemblagemengsel is eerder beschreven. 6 Deze en andere benaderingen zijn echter afhankelijk van gemeenschappelijke linkersequenties tussen de geassembleerde delen, die in onze benadering niet nodig zijn. Helaas waren we niet in staat om onze aanpak te testen voor de gelijktijdige assemblage van een bibliotheek in een enkel reactiemengsel vergelijkbaar met dat beschreven door Ramon en Smith. 6

    We evalueerden de foutenpercentages en locatie van fouten voor een kleine subset van de gekloonde bibliotheek. Het foutenpercentage per basenpaar voor de gesynthetiseerde stukken is ongeveer 1 orde van grootte groter dan het foutenpercentage dat is gerapporteerd voor de onderliggende techniek door Gibson et al. 4 Hoewel we dit niet direct kunnen verklaren, is het vermeldenswaard dat de gebruikte oligonucleotiden van een andere leverancier kwamen dan in het oorspronkelijke onderzoek (Sigma in ons geval en IDT in het geval van Gibson et al. 4).

    We hebben een bibliotheek van 42 fusiegenen gegenereerd in eenstapsreacties met behulp van een nieuwe benadering op basis van de eenstaps isotherme assemblage-kloneringstechniek. Dit vermijdt een groot aantal PCR-amplificaties en meerdere tussenliggende kloneringsstappen. We laten zien dat sequenties tussen 30 en 255 bp kunnen worden gesynthetiseerd tijdens de assemblage van een vector met een PCR-fragment met een grootte tussen 500 en 2700 bp. Het ontwerp en de montage van de constructies was zeer eenvoudig in vergelijking met andere state-of-the-art methoden en is compatibel met automatisering. Daarom verwachten we dat deze eenvoudige benadering, in combinatie met rigoureuze screeningsmethoden, gemakkelijk in veel toepassingen kan worden geïmplementeerd en op grote schaal kan worden gebruikt in zowel moleculaire als synthetische biologie.


    Gistexpressiecassettes produceren

    Traditioneel kan het genereren van expressiecassettes voor gisttransformatie 5 dagen duren. NEBuilder verkort die tijd tot één dag door het protocol te vereenvoudigen tot een enkele DNA-assemblagereactie. DNA-fragmenten met bijvoorbeeld de gewenste promotor, selecteerbare marker en doelwitgen worden geamplificeerd met overlappende homologiegebieden en ingevoegd in een gelineariseerde cassette, klaar voor transformatie in gist diezelfde dag.

    Het gebied van synthetische biologie heeft geleid tot vooruitgang in het genereren van biobrandstoffen, groene chemie en het begrijpen van het minimale genoom. Veel van deze technieken vereisen complexere DNA-assemblages en verbeteringen in deze methodologieën bieden gestroomlijnde en vereenvoudigde alternatieven voor traditioneel klonen. NEBuilder pakt de beperkingen aan die gepaard gaan met anders meer gecompliceerde assemblagebenaderingen en opent de deur voor nieuwe kansen in het veld.

    Gibson Assembly® is een geregistreerd handelsmerk van Synthetic Genomics, Inc.

    Een of meer van deze producten vallen onder een of meer patenten, handelsmerken en/of auteursrechten die eigendom zijn van of worden beheerd door New England Biolabs, Inc.

    Veel dank aan onze gastblogger Lydia Morrison van New England Biolabs.

    Lydia Morrison is biochemicus van opleiding en contentmarketeer van beroep.