Informatie

Magnetisch geactiveerde celsortering versus FACS


Bij het sorteren van celpopulaties is het mogelijk om magnetisch geactiveerde celsortering of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken. Ik vraag me af wanneer je een van beide technieken zou kiezen en wat de voor- en nadelen van elke techniek zijn.

Omdat FACS cellen één voor één sorteert, kan ik me voorstellen dat magnetisch geactiveerde celsortering een sneller proces is. Dus ik denk dat als tijd een belangrijke factor is, dit kan worden gebruikt om je beslissing op te baseren. Ook door cellen één voor één te sorteren neem ik aan dat FACS een stuk nauwkeuriger is, en tot minder 'besmetting' zal leiden.

Dus, zijn er? andere factoren hier spelen die de keuze van magnetisch geactiveerde celsortering boven FACS kunnen beïnvloeden, en wat zijn de? voors en tegens van deze technieken respectievelijk?


Magnetisch geactiveerde celsortering (PDF-download), of MACS, is een procedure die is ontwikkeld door Miltenyi Biotec om cellen te scheiden van complexe mengsels met behulp van met antilichaam gecoate magnetische nanodeeltjes. De antilichamen zijn specifiek voor bepaalde celoppervlakkenmerkers, ofwel uitgedrukt op uw populatie van interesse (positieve selectie), ofwel uitgedrukt op ongewenste celtypes (negatieve selectie). Nadat de met antilichaam beklede kralen aan het celmengsel zijn toegevoegd en geïncubeerd, wordt de suspensie toegevoegd aan een speciale scheidingskolom voor eenmalig gebruik die is bevestigd aan een magneet, waaraan de kralen blijven plakken, terwijl ongelabelde cellen erdoorheen stromen. Als u een negatieve selectie uitvoert, is de doorstroom uw populatie van belang en worden de gebonden kralen en cellen weggegooid. Als uw cellen van belang aan de korrels zijn gebonden (positieve selectie), wordt de kolom meerdere keren gewassen om ervoor te zorgen dat ongebonden of zwak gebonden cellen worden doorgespoeld, vervolgens wordt de kolom van de magneet verwijderd en worden de cel-kraalcomplexen geëlueerd .

Bij fluorescentie-geactiveerde celsortering of FACS wordt het aanvankelijke complexe celmengsel eerst gelabeld met een of meer celoppervlakmarker-specifieke antilichamen die zijn geconjugeerd aan fluorescerende kleurstoffen. Er kunnen ook cellen worden geanalyseerd die een of meer recombinante fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in combinatie met een gen van belang, wat selectie van cellen mogelijk maakt zonder gebruik te maken van antilichamen. Na incubatie- en wasstappen worden rode bloedcellen gelyseerd, bij analyse van volbloed. De reden voor RBC-lysis wordt hieronder weergegeven:

Zonder lysis overweldigen de RBC's de cytometer, aangezien ze ongeveer 95% van de cellen in menselijk volbloed uitmaken. Witte bloedcellen (leukocyten) daarentegen vormen slechts 0,1-0,2% van de cellen en lymfocyten tussen ongeveer 15 en 50% van de leukocyten.

Het celmengsel wordt vervolgens geanalyseerd op een celsorteerder zoals een BD FACSAria.

Van: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fluorescence_Assisted_Cell_Sorting_%28FACS%29_B.jpg">RosetteSep-systeem voor die specifieke vereiste). MACS vereist geen vrij duur specifiek instrument, hoewel automatische platforms beschikbaar zijn als Aan de andere kant zijn de meeste MACS-gekwalificeerde kralen meestal alleen verkrijgbaar bij Miltenyi, dus als ze geen kralen met uw specifieke marker van interesse beschikbaar hebben, moet u de vervoeging zelf doen, ten koste van tijd en mogelijk kostbaar antilichaam terwijl u de omstandigheden optimaliseert Fluorescerende geconjugeerde antilichamen zijn zeer gebruikelijk en verkrijgbaar bij praktisch ontelbare bedrijven, dus tenzij u met een zelfgegenereerd antilichaam werkt, is het veel waarschijnlijker dat u er vrij gemakkelijk een voor FACS kunt vinden. Daar zijn MACS-korrels die antilichamen bevatten die zijn gericht tegen bepaalde fluoroforen, dus u kunt flow-antilichamen voor MACS gebruiken, hoewel optimalisatie waarschijnlijk nog steeds nodig is. Ten slotte is MACS-scheiding alleen een optie voor cellen waarvan de marker van belang op het celoppervlak wordt uitgedrukt.

Een van de grote voordelen van FACS is meerkleurenkleuring (afhankelijk van het instrument dat u gebruikt). Dit maakt het veel eenvoudiger om potentieel zeldzame populaties te zuiveren die alleen worden gedifferentieerd door hun gecombineerde expressie van een aantal oppervlaktemarkers, waardoor meerdere poortstappen nodig zijn. Als dit door MACS zou worden bereikt, zou u meerdere zuiveringsrondes moeten doorlopen, iets dat langer zou kunnen duren dan FACS en niet noodzakelijk haalbaar is, aangezien er een bepaald aantal cellen nodig is voor elke MACS-run. Met FACS kunnen deze zeldzame populaties (die slechts tientallen of honderden cellen per miljoen zijn) net zo gemakkelijk worden verzameld als meer algemene. Ook zijn er, zoals hierboven vermeld, meer antilichamen beschikbaar voor flow/FACS dan voor directe MACS. Bovendien maakt FACS het mogelijk om cellen te sorteren die GFP en verwanten tot expressie brengen, zodat u populaties kunt verzamelen op basis van interne markers.


Magnetische celscheiding en celisolatie

Magnetische celscheiding, ook bekend als immunomagnetische celscheiding of magnetische celsortering, omvat het richten op cellen voor selectie of uitputting met behulp van antilichamen of liganden die zijn gericht tegen specifieke celoppervlakantigenen. Gelabelde cellen zijn verknoopt met magnetische deeltjes, ook bekend als magnetische kralen, die kunnen worden geïmmobiliseerd zodra een elektromagnetisch veld wordt aangelegd.

Vanwege de snelheid en eenvoud is magnetische celscheiding een van de meest gebruikte methoden waarmee wetenschappers sterk gezuiverde populaties van specifieke celsubsets isoleren.


Fluorescentie- en magnetisch geactiveerde celsorteringsstrategieën om spermatozoa te scheiden waarbij meerdere bijdragers betrokken zijn van biologische mengsels voor menselijke identificatie

Er is geen effectieve methode ontwikkeld om zaadcellen van verschillende mannen te onderscheiden in meerverdachte zedenzaken. Hier hebben we MACS en FACS gecombineerd om spermacellen van een enkele donor te isoleren uit forensische mengselmonsters, waaronder vrouwelijke vaginale epitheelcellen en spermacellen van meerdere bijdragers. Sperma uit vaginale uitstrijkjes werden geïsoleerd door MACS met behulp van FITC-geconjugeerd A-kinase-ankereiwit 3 (AKAP3) -antilichaamdoelwit. Individuele spermacellen waarbij twee of drie donoren betrokken waren, werden gescheiden door FACS met behulp van FITC-gelabeld bloedgroep A/B-antigeenantilichaam. Deze procedure werd verder getest in twee nep-multi-verdachte aanranding en één praktijkvoorbeeld. Onze resultaten toonden aan dat volledige STR-profielen van een enkele donor met succes konden worden verkregen uit sperma / epitheelcellen en spermamengsels van twee bijdragers. Voor ongebalanceerde sperma/epitheelcellen en mengsels van spermacellen, toonden gevoeligheidsresultaten aan dat doelcellen konden worden gedetecteerd bij een mengverhouding van respectievelijk 1:32 en 1:8. Hoewel deze procedure in hoge mate afhankelijk is van het aantal cellen en bloedgroepen of de secretorstatus van de individuen, zou deze procedure nog steeds nuttige hulpmiddelen zijn voor forensische DNA-analyse van gevallen van multi-verdachte aanranding door het gecombineerde gebruik van FACS en MACS op basis van sperma-specifiek AKAP3-antigeen en antigeen van de menselijke bloedgroep.

Figuren

Figuur 1. Western-blot-analyse van expressie...

Figuur 1. Western-blot-analyse van expressie van AKAP3 in buccale en vaginale epitheelcellen...

Figuur 2. Immunofluorescentielokalisatie van AKAP3 in...

Figuur 2. Immunofluorescentielokalisatie van AKAP3 in zaadcellen.

De expressie en lokalisatie van AKAP3...

Figuur 3. Immunofluorescentielokalisatie van bloedgroep...

Figuur 3. Immunofluorescentielokalisatie van bloedgroepantigenen in B-type zaadcellen.

Figuur 4. Representatieve gegevens van FACS-detectie...

Figuur 4. Representatieve gegevens van FACS-detectie van MACS gescheiden zaadcellen van sperma en ...

Figuur 5. Representatieve cytofluorimetrische analyse van de...

Figuur 5. Representatieve cytofluorimetrische analyse van de O-type sperma- en A-type zaadcelmengsels met behulp van...

Figuur 6. Vertegenwoordiger CE van de STR...

Figuur 6. Representatieve CE van de STR-typering met ID-plus door FACS van spermamengsels...

Figuur 7. Cytofluorimetrische analyse van nepmonster...

Figuur 7. Cytofluorimetrische analyse van schijnmonstermengsel S1 met vrouwelijke vaginale epitheelcellen, A-type...

Figuur 8. CE van de STR-typering…

Figuur 8. CE van de STR-typering met ID-plus door FACS van nepmonstermengsel...


Magnetische geactiveerde celsortering systeacutem gerelateerde artikelen

PRODUCTEN

Xinhai minerale verwerkingsapparatuur omvat voornamelijk: slijpapparatuur, flotatieapparatuur, ontwateringsapparatuur, magnetische scheidingsapparatuur, enzovoort.

OPLOSSINGEN

Professionele beneficiation 20 jaar, eigen minerale onderzoeks- en ontwerpinstituut, meer dan 70 soorten verbandervaring.

Minerale verwerking EPC

Geoptimaliseerde oplossingen bieden voor uw mijn, one-stop-service voor mineraalverwerkingsfabriek!

Cultuur

Wat u nodig heeft, is wat wij kunnen doen! We zullen niet alleen hoogwaardige apparatuur leveren, maar ook de meest rationele processtroom, de beste apparaatconfiguratie en de meest attente turnkey-services voor de klanten.


2. Wat zijn de celtypen die kunnen worden gesorteerd op FACS?

Het celtype dat kan worden gesorteerd, is beperkt tot de grootte van de cel, de kwaliteit van het instrument en de vindingrijkheid van de onderzoeker.

Celsorteerders hebben een mondstuk en de grootte van het mondstuk bepaalt hoe groot (of klein) een cel kan worden gesorteerd. Meestal moeten cellen 4-5 keer kleiner zijn dan het gebruikte mondstuk.

De meeste sorteerders die tegenwoordig op de markt zijn, kunnen sorteren van zeer kleine cellen (bacteriën) tot zeer grote cellen. Er is zelfs een speciale sorteerder die hele grote klompjes cellen en zelfs kleine organismen kan sorteren.


Discussie

De klassieke methode van iPSC-afleiding vereist arbeidsintensieve en tijdrovende handmatige isolatie, uitbreiding en karakterisering van meerdere kolonies. Er moeten dus betere methoden worden ontwikkeld om een ​​efficiëntere generatie van iPSC's voor grootschalige studies mogelijk te maken. Hier rapporteren we een methode voor het genereren van iPSC's door magnetische geactiveerde celsortering met behulp van TRA-1-60 of SSEA4-antilichamen van een geherprogrammeerde celpool. Deze methode is geschikt om te selecteren: bonafide iPSC's gegenereerd met behulp van integrerende en niet-integrerende methoden. Vergelijking van pool-geselecteerde cellen met isogene klonaal afgeleide lijnen laat zien dat pools sterk lijken op klonen in alle beoordeelde karakteriseringscriteria. Bovendien lijken alle klonen sterk op elkaar met behulp van de onderzochte karakteriseringscriteria. Onze studies bieden een aantrekkelijk alternatief voor klonale afleiding van iPSC's met behulp van streng geselecteerde celpools. Merk op dat een recent rapport ook een vergelijkbare benadering beschreef om met succes iPSC's als celpools te genereren [24].

We ontdekten ook dat vroege passage-pool geselecteerde iPSC's de expressie van CD71 behouden, een marker van erythroblast, de somatische cel van oorsprong in deze onderzoeken. Dit verhoogt de mogelijkheid dat een vroege ronde van negatieve selectie met behulp van CD71-antilichaam de zuiverheid van aanvankelijk gesorteerde pluripotente celpopulaties kan verhogen en de behoefte aan meerdere sorteerronden kan verminderen. Onlangs is een manuscript gepubliceerd dat het gebruik van CD71 en CD13 als negatieve selectiemarkers voor het vaststellen van iPSC's uit van bloed afgeleide bronnen beschrijft [25].

Recente studies toonden een significante variabiliteit in differentiatiepotentieel tussen iPSC-klonen afkomstig van dezelfde donor [5-8]. Bovendien is er significante variatie gerapporteerd, zelfs op het niveau van een enkele herprogrammeerde cel [26]. Deze klonale verschillen kunnen voortkomen uit variaties in DNA-sequenties in de oorspronkelijke niet-klonale oudercelpopulaties, mutaties die zijn verkregen tijdens het herprogrammeringsproces of daaropvolgende expansie en kweek, of variaties in resterende epigenetische handtekening van de oudercellen [8, 27]. Deze bevindingen hebben gesuggereerd dat het nodig is om meerdere iPSC-klonen te onderzoeken in de meeste fenotyperingsassays. Onze gegevens met behulp van de niet-integrerende Sendai-virale herprogrammeringsvectoren suggereren echter dat individuele klonen mogelijk niet nodig zijn. Het gebruik van gepoolde iPSC's kan meerdere klonen vervangen, aangezien iPSC-klonen die zijn afgeleid van hetzelfde individu opmerkelijk veel op elkaar lijken en afgeleide iPSC's kunnen bundelen in hun potentieel om te differentiëren in meerdere lijnen. Een deel van deze consistentie kan te wijten zijn aan het gebruik van het niet-integrerende Sendai-virus als herprogrammeringsmethode. Een eerder rapport met niet-integrerende episomale vectoren onthulde ook zeer weinig kloon-naar-kloon-variabiliteit in iPSC-herprogrammering wanneer afgeleid van dezelfde donor [11]. Ondanks de voordelen van het gebruik van van pool afgeleide iPSC's, kunnen in onderzoeken waar fenotypische verschillen tussen iPSC's van verschillende genotypen klein zijn, dergelijke subtiele veranderingen verloren gaan in een "pool" van opnieuw geprogrammeerde iPSC's. In dergelijke gevallen zal het gebruik van meerdere klonen nodig zijn om zinvolle en statistisch significante conclusies te trekken. Het verhogen van het aantal biologische replica's van iPSC-celpools die zijn afgeleid van meerdere donoren van hetzelfde genotype, zou echter ook dergelijke beperkingen kunnen verlichten, vooral gezien de mogelijkheid om poolselectie te automatiseren.

Samenvattend hebben we een methode ontwikkeld voor het genereren van iPSC's als geherprogrammeerde celpools via MACS van TRA-1-60 of SSEA4-positieve kandidaat-iPSC's. Deze methode is efficiënter, minder tijdrovend en beter gestandaardiseerd dan klonale selectie en kan een snelle generatie van iPSC's uit een groot aantal patiëntmonsters vergemakkelijken.


Isolatiemethoden voor menselijke CD34-subsets met behulp van fluorescerende en magnetische geactiveerde celsortering: een in vivo vergelijkend onderzoek

Acuut myocardinfarct (AMI) en de daaruit voortvloeiende hartschade en hartfalen zijn wereldwijd de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit. Meerdere onderzoeken hebben de bruikbaarheid van CD34+-cellen voor de behandeling van acute en ischemische hartziekte onderzocht. De optimale strategie om CD34-cellen uit klinische bronnen te verrijken is echter niet bekend. We onderzochten de werkzaamheid van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetische kralencelsortering (MACS) methoden voor CD34-celisolatie van gemobiliseerde menselijke mononucleaire perifere bloedcellen (mhPBMNC's).

Methoden:

mhPBC's werden verwerkt na acquisitie met behulp van FACS of MACS volgens klinisch vastgestelde protocollen. De levensvatbaarheid van de cellen, de zuiverheid van de CD34-cellen en de karakterisering van de expressie van oppervlaktemarkers werden beoordeeld met behulp van een flowcytometer. Voor in vivo karakterisering van hartherstel hebben we LAD-ligatiechirurgie uitgevoerd op 8-10 weken vrouwelijke NOD/SCID-muizen, gevolgd door intramyocardiale transplantatie van niet-geselecteerde mhPBMNC's, FACS of MACS verrijkte CD34+-cellen.

Resultaten

Zowel MACS- als FACS-isolatiemethoden bereikten hoge zuiverheidsgraden, levensvatbaarheid en verrijking van CD34+-cellen. In vivo-onderzoeken na een myocardinfarct toonden retentie van CD34+ in het peri-infarctgebied aan tot 30 dagen na transplantatie. Vastgehouden CD34+-cellen waren geassocieerd met verhoogde angiogenese en verminderde ontsteking in vergelijking met niet-geselecteerde mhPBMNC's of PBS-behandelingsarmen. Hartlitteken en fibrose, zoals vastgesteld door middel van immunohistochemie, waren verminderd in FACS- en MACS CD34+-behandelingsgroepen. Ten slotte resulteerden verminderde littekens en verhoogde angiogenese in verbeterd hartfunctioneel herstel, zowel op de globale en regionale functie als op de evaluatie van hermodellering door middel van echocardiografie.

Conclusie

Op cellen gebaseerde therapie met behulp van verrijkte CD34+-cellen gesorteerd op FACS of MACS resulteert in een beter hartherstel na ischemisch letsel in vergelijking met niet-geselecteerde mhPBMNC's. Beide verrijkingstechnieken bieden een uitstekend herstel en zuiverheid en kunnen evengoed worden gebruikt voor klinische toepassingen.


Resultaten

Vergelijkende proteomische analyse van op MACS en FACS gebaseerde strategieën onthult zeer overvloedige microgliale kerneiwitten en benadrukt verschillen tussen beide zuiveringsstrategieën

We hebben TMT-MS toegepast om de proteomen van CD11b + microglia te verkrijgen van 4 maanden oude mannelijke C57Bl6/J wildtype muizen (N = 10) geïsoleerd met behulp van twee verschillende strategieën: magnetisch geactiveerde celsortering (MACS N = 5, > 90% verrijking [25]) en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS, N = 5, gemiddeld 30.000 totale cellen per monster). MACS-verrijkte en FACS-geïsoleerde microglia-cellysaten in 8 M ureum werden verteerd met LysC en Trypsine, gelabeld met isobare multiplex TMT's en geanalyseerd door op synchrone precursorselectie (SPS) gebaseerde MS3 (SPS-MS3) (Fig. 1b). Vanwege de isobare aard van de tags vertonen alle gedeelde peptiden van de 10 monsters dezelfde biochemische eigenschappen (d.w.z. exacte massa, ionisatie-efficiëntie en retentietijd) in de MS1- of voorloperscan. Alleen volgend op MS/MS (of MS3-SPS) geeft elk tagfragment en unieke reporterionen vrij, die vervolgens worden gebruikt voor peptidekwantificering. Een groot voordeel van op multiplex TMT gebaseerde kwantificering is dus dat de peptiden over alle monsters worden gepoold, wat het signaal van de precursor-peptide in de massaspectrometer voor eiwitten die alle monsters gemeen hebben, tot een factor 10 verhoogt (bijv. TMT 10-plex) wanneer vergeleken met het afzonderlijk uitvoeren van elk monster door LFQ. Dit is vooral belangrijk bij het isoleren van kleine aantallen cellen (

30.000) zoals in deze studie. In totaal hebben we 6404 peptiden geïdentificeerd die zijn toegewezen aan 1876 eiwitgroepen. Hiervan werden 1791 eiwitten gekwantificeerd in ten minste 3 van de 5 replica's in elke groep, en 4 vertoonden expressiepatronen die uniek zijn voor alleen de MACS-verrijkte groep, waarvan we er 2 hebben uitgesloten vanwege een laag eiwit-FDR. Ondanks de potentiële relatieve voor- of nadelen van op FACS en MACS gebaseerde microgliale zuiveringsstrategieën, veronderstelden we dat microgliale kerneiwitten door beide benaderingen met een hoge abundantie moeten worden gemeten. We hebben ons eerst gericht op consensus tussen beide proteomen en hebben 10 eiwitten geïdentificeerd (Hmga1, Msn, Pfn1, Myh9, Coro1a, S100a9, Cap1, Cotl1, Ctsd) die aan de volgende criteria voldeden: (1) zeer overvloedig (> 90e percentiel) in MACS en FACS microgliale proteomen in onze gegevens, en (2) het meest tot expressie gebracht op eiwitniveau in microglia in vergelijking met neuronen en andere gliacellen op basis van een bestaande celtype-specifieke proteomische referentiedatabase [22].

Hoewel op FACS en MACS gebaseerde zuivering van microglia een hoge microgliale zuiverheid oplevert (> 90% voor beide), kunnen er significante verschillen bestaan ​​in de soorten geïdentificeerde eiwitten. Door FACS- en MACS-microgliale proteomen te vergelijken, werden in totaal 953 eiwitten differentieel verrijkt (P < 0,05, ongepaarde t-test), en van deze 815 voldeden er 815 aan significantiedrempels op het FDR < 5%-niveau. Van de 953 differentieel verrijkte eiwitten waren er 685 verhoogd en 268 eiwitten waren in overvloed afgenomen in het FACS-microglia-proteoom. Toen we de relatieve abundantie van de 685 significant verhoogde eiwitten vergeleken, hadden 36 eiwitten een 2-voudige of grotere toename in abundantie (Fig. 2a, effen oranje stippen afgebakend door een stippellijn) in het FACS-proteoom dan in het MACS-proteoom (top 5 : Apex1, Fam3c, Lcn2, Lbr, S100a9). Van de 268 significant verminderde eiwitten hadden 65 eiwitten een 2-voudige of grotere afname in overvloed in het FACS-proteoom (Fig. 2a, effen blauwe stippen afgebakend door stippellijn), dwz een verhoogde abundantie in MACS-proteoom (top 5: Gap43 , Gpm6b, Sh3gl2, Psip1, Hmgn3). Genontologie (GO) analyse van eiwitten nam significant af (N = 268) in het FACS microglia-proteoom duidde op een oververtegenwoordiging van "mitochondriale" en "synaptische" eiwitten en eiwitten die betrokken zijn bij "elektronentransportketen", "neurotransmittertransport" en "synaptische transmissie" -processen (figuur 2b). Omgekeerd waren "cytosolische", "endoplasmatisch reticulum (ER)" en "ribosoom" cellulaire componenten, en eiwitten die betrokken zijn bij processen zoals "regulatie van eiwitmetabolisme" en "immuunsysteem" oververtegenwoordigd door de significant toegenomen eiwitten (N = 685) in het FACS microglia-proteoom (figuur 2b). De cytosolische en ER-bias van het FACS-proteoom pleit tegen een nucleaire proteomische bias die zou kunnen worden verwacht met behulp van de FACS-benadering.

Verrijking van microglia-specifieke eiwitten en uitputting van niet-microgliale eiwitten door FACS. een Scatterplot met relatieve abundantie van alle differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (N = 953) tussen FACS-geïsoleerd microglia-proteoom en MACS-verrijkt microglia-proteoom (alle stippen vertegenwoordigen P < 0,05). Stippellijnen differentiëren eiwitten met een Log2 vouwverandering van ten minste 2. Vaste oranje stippen geven eiwitten aan die significant hoger zijn in het FACS-proteoom of lager in het MACS-proteoom. Vaste blauwe stippen geven eiwitten aan die significant hoger zijn in het MACS-proteoom of lager in het FACS-proteoom. B Resultaten van Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse van 953 differentieel tot expressie gebrachte eiwitten tegen een achtergrondlijst van totale eiwitten geïdentificeerd in de huidige dataset. Representatieve GO-termen (top 3) van elk van de drie GO-groepen. De mate van verrijking van elke GO-term wordt aangegeven door de Z-score (X-as). Verticale rode en zwarte lijnen geven een Z-score van 1,96 aan. C Vulkaanplot die de verdeling van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten tussen FACS-geïsoleerde en MACS-verrijkte microglia-proteomen weergeeft. Celtype-specifieke markers gedefinieerd door een referentie-proteoom, Sharma et al. [22], toont een significante verrijking van microgliale specifieke eiwitten in het FACS-proteoom (P < 0,05, ongepaarde t-test). Rode stippen = microglia, turquoise stippen = neuron, roze stippen = astrocyt, gele stippen = oligodendrocyt. Grijze stippen vertegenwoordigen differentieel tot expressie gebrachte eiwitten met a P > 0,05. Logboek2 fold-change wordt weergegeven op de X-as, −Log10 (P-waarde) wordt weergegeven op de Y-as en de horizontale stippellijn geeft aan: P waarde van 0,05. NS Consensus microgliale eiwitten tussen MACS en FACS microgliale proteomen (N = 203). Uit deze lijst werd Moesin (Msn) gekozen voor verdere validatie

Deze resultaten laten zien dat ondanks het gebruik van identieke massaspectrometriebenaderingen en hoge cellulaire zuiverheid verkregen door MACS en FACS-gebaseerde microgliale verrijkingsbenaderingen, de proteomen van elke strategie inderdaad heel verschillend zijn. Het proteoom van met MACS verrijkte microglia lijkt namelijk sterk bevooroordeeld te zijn naar synaptische eiwitten, wat een significante neuronale component in deze monsters suggereert, terwijl het FACS-geïsoleerde proteoom is verrijkt voor de immuunfunctie, wat wijst op een hogere verrijking van microgliale eiwitten. Ondanks deze methodologische verschillen identificeren we een kernset van zeer overvloedige microgliale eiwitten (Fig. 2d, N = 203).

FACS-geïsoleerde microgliale proteomen resulteren in een hogere verrijking van microgliale eiwitten en uitputting van niet-microgliale eiwitverontreinigingen

In vergelijking met MACS heeft FACS het extra voordeel dat het met vertrouwen niet-cellulaire maar eiwitrijke elementen die aanwezig zijn in celpreparaten uit de hersenen verwijdert. Op basis hiervan en onze waargenomen proteomische verschillen tussen op FACS en MACS gebaseerde benaderingen, veronderstelden we dat de op FACS gebaseerde strategie resulteert in een grotere verrijking van microgliale eiwitten en uitputting van niet-microgliale eiwitten die mononucleaire celpreparaten uit de hersenen kunnen besmetten. Daarom hebben we celtype-verrijkingsanalyse van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten uitgevoerd met behulp van eiwitmarkerlijsten die zijn afgeleid van bestaande referentieproteomen van vier gezuiverde muizenhersenceltypen - microglia, neuronen, astrocyten en oligodendrocyten [22] (Fig. 2c). Hoewel endotheelcellen een belangrijke hersencelpopulatie vertegenwoordigen, was er op het moment van dit werk geen bestaande referentie voor gezuiverd endotheelcelproteoom. Van de 953 eiwitten die differentieel tot expressie werden gebracht door FACS- versus MACS-proteomen te vergelijken, zagen we een duidelijke verrijking van eiwitten die sterk tot expressie worden gebracht door microglia in het FACS-proteoom. De microgliale eiwitten met een hoge overvloed aan FACS-proteoom omvatten Fam49b, Ptgs1, Clic1, Anxa5 en Psme2 (Fig. 2c, rode vaste stippen). Over het algemeen werden microglia-specifieke eiwitten gekwantificeerd bij hogere abundanties in FACS in vergelijking met MACS-proteomen (Fig. 2d, Aanvullende Figuur 2A). Omgekeerd waren neuronale, astrocytische en oligodendrogliale eiwitten relatief zeer overvloedig in het MACS-proteoom (aanvullende figuur 2B-D).

Naast het gebruik van een referentie-hersenceltype-specifiek proteoom [22], analyseerden we onze gegevens verder voor celtypeverrijking met behulp van een referentie-transcriptomische (RNAseq) dataset van vijf gezuiverde muishersenceltypes: microglia, neuronen, astrocyten, oligodendrocyten, en endotheelcellen [11] (aanvullende figuur 2E). Net als bij onze waarnemingen met behulp van referentie-proteomische gegevens, hebben we een hogere representatie van microglia-specifieke genen waargenomen bij eiwitten die zijn verrijkt in het FACS-proteoom, terwijl neuronale, astrocytische en oligodendrogliale genen sterker vertegenwoordigd waren in het MACS-proteoom (aanvullende figuur 2E). Interessant is dat genen die zeer overvloedig voorkomen in endotheelcellen ook meer voorkomen in het FACS-proteoom (aanvullende figuur 2E, groene stippen). Deze intrigerende verrijking van endotheliale markers in het op FACS gebaseerde microgliale proteoom zou kunnen wijzen op moleculaire overlap tussen microglia en endotheelcellen of zou beperkingen van eerdere endotheliale transcriptomen kunnen benadrukken. Dit kan echter waarschijnlijk verder worden opgelost door toekomstige gezuiverde endotheliale proteomische studies.

Omdat zowel referentie-proteomische als transcriptomische celtype-specifieke datasets die voor onze analyses werden gebruikt, onafhankelijk waren, hebben we de mate van overlap beoordeeld tussen celspecifieke markers die door deze referenties worden geïdentificeerd (aanvullende figuur 2F). Interessant genoeg identificeerden de twee referentieceltype-markerlijsten die we gebruikten minimaal overlappende en variërende aantallen eiwitten voor elk celtype. Van de 140 microglia-specifieke eiwitten die op proteomisch niveau zijn geïdentificeerd, werden bijvoorbeeld slechts 87 ook geïdentificeerd als verrijkt in microglia op transcriptomisch niveau (aanvullende figuur 2F). Ondanks deze verschillen in referentiedatasets, benadrukt de consensus tussen onze beide celverrijkingsanalyses de validiteit van onze bevindingen met betrekking tot de voordelen van de FACS-benadering ten opzichte van MACS-verrijking voor microgliale proteomics. Een gedetailleerde samenvatting van de differentiële weergave van hersenceltype-specifieke genen en eiwitten wordt gegeven in Tabel 1.

Om de validiteit van de schijnbare cellulaire vooroordelen van MACS versus FACS-proteomen in onze dataset verder te bevestigen, vergeleken we onze resultaten met ons recent gepubliceerde op MACS gebaseerde microgliale proteoom van muizen van wildtype muizen en 5xFAD-muismodellen waarin 4133 eiwitten werden geïdentificeerd door TMT-MS in met CD11b + MACS verrijkte microglia [25]. In deze secundaire analyse van een onafhankelijk MACS-verrijkt microgliaal proteoom, hebben we de gegevens vergeleken met de referentieceltype-proteomen [22] en ontdekten dat 78,5% van alle eiwitten niet op een bepaald celtype waren toegewezen, terwijl slechts 4,5 % was microgliaal en 17% van de eiwitten was verrijkt in andere celtypen (aanvullende figuur 3A). Hoewel microglia-specifieke eiwitten zoals Msn en Cotl1 zeer overvloedig aanwezig waren in het met MACS verrijkte microgliale proteoom, werden neuronale eiwitten (Camk2a, Gap43), astrocyteneiwitten (Gfap, Aldoa) en oligodendrocyteiwitten (Mbp) ook geïdentificeerd als even zeer overvloedige eiwitten (Aanvullende figuur 3B, >90e percentiel van relatieve overvloed). Niet-microgliale eiwitten werden ook gevonden in het FACS-geïsoleerde microgliale proteoom met een relatief hoge overvloed (aanvullende tabel 1). Mbp (90e percentiel), Gfap (60e percentiel), Camk2a (>75e percentiel) waren bijvoorbeeld nog steeds relatief overvloedig aanwezig in het microgliale proteoom van FACS, hoewel vele malen lager in vergelijking met het MACS-proteoom waar deze drie eiwitten werden gevonden op >90e percentiel van overvloed .

Gezamenlijk laten deze celtype-verrijkingsanalyses van onze proteomische gegevens zien dat op MACS gebaseerde proteomen nog steeds verontreinigd zijn door niet-microgliale eiwitten, ondanks de hoge microgliale cellulaire zuiverheid die waarschijnlijk te wijten is aan overblijvend acellulair afval, terwijl op FACS gebaseerde microgliale isolatie resulteert in een zuiverder microgliaal proteoom dat is minder verontreinigd door neuronale, astrocytische en oligodendrogliale eiwitten. De aanwezigheid van niet-microgliale eiwitten in relatief hoge abundantie in het FACS-geïsoleerde microgliale proteoom kan meer indicatief zijn voor fagocytische opname op niet-microgliale cellulaire elementen door microglia [45]. Een andere interessante bevinding is dat de meeste eiwitten die tot expressie worden gebracht in microglia niet specifiek zijn voor microglia, maar worden gedeeld door verschillende celtypen.

Cotl1 en Msn worden sterk tot expressie gebracht door microglia in de hersenen van volwassen muizen

Op basis van onze consensusbevindingen tussen verschillende microglia-verrijkingsstrategieën, hebben we een kernset van zeer overvloedige microgliale eiwitten gedefinieerd (Fig. 2d, N = 203) bij volwassen muizen die kunnen worden gebruikt als indicatoren voor microgliale abundantie in toekomstige proteomische studies. Onder eiwitten met een hoge overeenstemming in microglia zijn verschillende eiwitten, waaronder Msn, Cotl1 en Bin1 geïdentificeerd als zeer overvloedig aanwezig in zowel FACS- als MACS-proteomen (Fig. 2d). We kozen Cotl1 en Msn voor aanvullende neuropathologische studies om expressie in de muizenhersenen te karakteriseren. Coactosine-achtig F-actine-bindend eiwit 1 (Cotl1) is een actine-bindend eiwit dat tot expressie wordt gebracht door immuuncellen, waaronder macrofagen, en er is recentelijk gerapporteerd dat het de actine-dynamiek reguleert bij de immuunsynaps [46, 47]. Cotl1 bindt samen met Msn ook meervoudig onverzadigde vetzuurchemokinen [48]. Bovendien wordt Cotl1 sterk en specifiek tot expressie gebracht door microglia op transcript- en eiwitniveaus [11, 22] die we eerder hebben geïdentificeerd als een nieuwe microglia-specifieke marker van een kwantitatieve TMT-MS proteomische analyse van MACS-verrijkte CD11b + microglia van volwassen muizen in normale, acute neuro-inflammatoire en chronische neurodegeneratieve toestanden [25]. In de huidige studie waren we in staat om onze eerdere bevinding van Cotl1 te repliceren als een microgliale marker met een significant hogere abundantie (1,4 keer hoger, P = 0,001) in het FACS-proteoom dan het MACS-proteoom. We immunogekleurde hersenen van 6 tot 7 maanden oude Cx3cr1 CreER-YFP-muizen op wildtype (WT) of 5xFAD-achtergronden met antilichamen tegen YFP/GFP, om microglia en Cotl1 te detecteren. Cx3cr1 CreER-YFP-muizen brengen YFP/GFP-immunofluorescentie tot expressie in Cx3cr1 + microglia in de hersenen [33, 34]. In de Cx3cr1 CreER-YFP -WT en Cx3cr1 CreER-YFP -5xFAD cortices werd Cotl1-immunofluorescentie specifiek gedetecteerd in GFP-immunofluorescerende microglia (aanvullende figuur 4A, pijl). De GFP + microglia in de Cx3cr1 CreER-YFP-WT-cortex leken ook morfologisch vertakt, maar die in de Cx3cr1 CreER-YFP-5xFAD-cortex namen een geactiveerde morfologie aan met kortere gezwollen processen en grotere cellichamen (aanvullende figuur 4A). We hebben eerder een vergelijkbaar morfologisch fenotype beschreven in een WT- en 5xFAD-muishersenen, evenals een kwantitatieve toename van Cotl1-expressie in 5xFAD-hersenen vergeleken met WT-hersenen [25].

Moesin (Msn) is een lid van de ezrin-radixin-moesin (ERM) familie van eiwitten die het C-terminale domein van corticale actinefilamenten verbinden met het plasmamembraan [49]. Buiten de hersenen wordt Msn aangetroffen in andere weefsels en celtypen, waaronder macrofagen, lymfocyten, epitheelcellen en endotheelcellen [50,51,52]. In de hersenen wordt Msn het meest overvloedig tot expressie gebracht door microglia in vergelijking met neuronen, oligodendrocyten of astrocyten, hoewel een proteoom van een endotheelcel in de hersenen momenteel ontbreekt [22]. Op transcriptniveau wordt Msn sterk tot expressie gebracht door endotheelcellen en microglia [10, 11, 22]. We hebben de hersenen van Cx3cr1 CreER-YFP-muizen immunologisch gekleurd op WT- of 5xFAD-achtergronden voor YFP/GFP (om microglia te detecteren) en Msn. In Cx3cr1 CreER-YFP -WT mouse cortex, we observed GFP immunofluorescence within the cell body and processes of ramified microglia (Fig. 3a, arrow) and detected diffuse Msn immunofluorescence in the same ramified microglia (Fig. 3a, arrow). We also observed Msn immunofluorescence in non-microglial cells which resembled endothelial cells (Fig. 3a, asterisk), consistent with previously reported Msn expression in endothelial cells [11]. In Cx3cr1 CreER-YFP -5xFAD mouse cortex, we observed GFP immunofluorescent microglia with an activated morphology and found strong Msn expression in the same microglia (Fig. 3a, arrow). We also observed GFP and Msn immunofluorescent microglia surrounding dense Aβ plaques (Fig. 3b, arrow) in Cx3cr1 CreER-YFP -5xFAD mouse cortex. Importantly, 5xFAD mice displayed a significant increase in Msn immunofluorescence in the cortex compared to control mice (Supplemental Figure 4B, P < 0,0001). Given that Msn is abundant in endothelial cells at the transcript level and the presence of GFP negative, Msn immunofluorescent non-microglial cells (Fig. 3a, asterisk), we stained brain tissue from 9 to 10 month old WT and 5xFAD mouse brains to detect CD31 (an endothelial marker) and Msn. In both WT and 5xFAD cortices, we observed CD31 and Msn immunofluorescence in endothelial cells (Fig. 3c, arrows) as well as cells immunofluorescent for Msn only (Fig. 3c, asterisk). Additionally, we stained the same brain sections with GFAP, to detect astrocytes, and Msn. In WT and 5xFAD cortices, GFAP immunofluorescent astrocytes (Fig. 3d, asterisk) did not display Msn immunofluorescence (Fig. 3d, arrow). Overall, while Msn is found in both ramified microglia and endothelial cells in normal brain and in regions distant from Aβ plaques, Msn expression is nearly exclusively found in microglia that surround Aβ plaques in 5xFAD mice.

Moesin is expressed by microglia and endothelial cells in mouse brain. een Representative immunofluorescence images of Cx3cr1 CreER-YFP -WT (N = 4) and Cx3cr1 CreER-YFP -5xFAD (N = 6) mouse cortex stained for microglia (GFP) and Msn. Arrow indicates microglia immunopositive for GFP and Msn. Asterisk indicates cells immunopositive for Msn only. B Representative immunofluorescence images of Cx3cr1 CreER-YFP -5xFAD (N = 6) mouse cortex stained for amyloid-beta (Aβ), microglia (GFP), and Msn. Arrow indicates Aβ plaque as well as microglia immunopositive for GFP and Msn. C Representative immunofluorescence images of WT (N = 3) and 5xFAD (N = 4) mouse cortex stained for endothelial cells (CD31) and Msn. Arrow indicates endothelial cells immunopositive for CD31 and Msn. Asterisk indicates cells immunopostive for Msn only. NS Representative immunofluorescence images of WT (N = 3) and 5xFAD (N = 4) mouse cortex stained for astrocytes (GFAP) and Msn. Arrow indicates cells immunopositive for Msn only. Asterisk indicates astroctyes immunopostive for GFAP only. Scale bar = 30 μm

These results validate two highly-abundant microglial specific proteins, namely Cotl1 and Msn, which can serve as markers of microglia in the mouse brain at normal and disease states and indicate possible roles for these proteins in microglial function under homeostatic and disease conditions.

Msn regulates Aβ phagocytosis and pro-inflammatory cytokine production by microglia

Based on our findings of Msn expression in mouse microglia distant and proximate to Aβ plaques in the 5xFAD mouse brain, we performed in-vitro functional studies using primary mouse microglia to determine the effect of Msn knockdown (KD) on microglial phagocytic properties (Fig. 4a). Msn siRNA resulted in > 90% reduction in Msn mRNA expression compared to control siRNA (Fig. 4b, P < 0,001). Primary neonatal mouse microglia were incubated with fluorescent-conjugated fAβ42 for 60 min and phagocytic uptake by CD45 + live microglia was assessed by flow cytometry [26]. Msn siRNA pre-treatment reduced Aβ phagocytic uptake by

25% (P = 0.0274) without affecting viability as compared to siRNA control under resting conditions (Fig. 4b). In the presence of LPS stimulation, we observed minimal effect of Msn siRNA (Fig. 4b), suggesting context-dependent functional roles for Msn in microglia. In this assay, we have previously shown that inhibition of actin-dependent processes by cytochalasin D completely inhibits Aβ uptake, confirming actin-dependent phagocytic uptake of Aβ rather than passive binding to the cell surface [26]. Next, we measured levels of cytokines and chemokines by Luminex assays in the culture supernatants derived from primary microglia that were treated with sham siRNA or siMsn for 24 h and then treated with LPS (or sham) for another 24 h as a strong pro-inflammatory challenge (Fig. 4a). As expected, LPS increased levels of TNF, IL-10, and other cytokines (Fig. 4d-i, IL6, G-GSF, IP-10/CXCL10, and MIP-1α/CCL3). Specifically, Msn siRNA enhanced LPS-induced increase in IL-10 (Fig. 4d) and TNF (Fig. 4f, P < 0.05) levels, although the former was not statistically significant. In sum, our in-vitro studies indicate that deletion of Msn from microglia impairs their ability to phagocytose Aβ and increases IL-10 and TNF-α release after an inflammatory stimulus.

Moesin knockdown impacts Aβ phagocytosis and pro-inflammatory cytokine production by microglia. een Overview of in-vitro knockdown studies in primary mouse microglia treated with Msn siRNA or sham siRNA under resting and LPS-stimulated conditions. B Results from qRT-PCR experiments demonstrating efficiency of Msn knockdown by siRNA as compared to sham siRNA. Y-axis represents relative mRNA expression (2-ΔΔCt method) normalized to Gapdh as housekeeping gene (three independent biological replicate experiments were performed per condition). C In-vitro phagocytic capacity of primary microglia for fAβ42 HiLyte488 following exposure to sham siRNA or Msn siRNA under resting and LPS-stimulated conditions. Phagocytic uptake of fAβ42 was measured as proportion of CD45 + microglia using untreated microglia as negative controls. For each sample, at least 2000 live CD45 + microglial events were captured. N = 3 independently performed biological replicate experiments. d-i Bar graphs displaying cytokine/chemokine data, shown as fluorescence intensity in arbitrary units (A.U.), obtained from microglial culture supernatants after siRNA sham or siRNA Msn treatment under resting and LPS-stimulated conditions: NS IL10, e IL6, F TNF, G G-CSF, H CXCL10, l CCL3. Error bars represent ± SEM. Unpaired t-test: *P < 0.05, ***P < 0,0001

Msn is a hub protein in a disease-associated proteomic co-expression module in human AD brain

In a recent large proteomic analysis of over 400 human post-mortem brains, we identified a consensus network of protein co-expression modules with robust associations to AD pathologies as well as cognitive traits [40]. In this network analysis, we identified a protein module (M4) that was highly correlated with higher neuropathological burden and worse cognitive outcomes this module was highly enriched in microglial and astrocytic proteins [40]. Msn is a hub protein, defined as a protein most central to module function with a high module membership value (kME), of this module (Fig. 5a, kMe = 0.807) as well as several other microglial proteins identified in the current mouse microglial proteomic analysis (Fig. 5a, red circles: ANXA5, CRYL1, TPP1, COTL1, CTSB, and CAP1). Msn protein abundance was significantly elevated in AD DLPFC compared to control or AsymAD DLPFC (Fig. 5b, P < 0,001). Furthermore, increased Msn levels were also present in AD brains even at the transcript level (Fig. 5c, P < 0.001) [41]. We observed that Msn protein abundance displayed a strong negative correlation with cognitive function (Fig. 5d, MMSE,R = − 0.51, P = 1.9e-12). Cognitive function was determined by the mini-mental status examination (MMSE) score where higher scores (> 24) represent better cognitive function and lower scores (< 24) represent cognitive dysfunction (or dementia) [53]. Furthermore, Msn protein abundance demonstrated a strong positive correlation with Aβ plaque burden (Fig. 5d, CERAD, R = 0.32, P = 2e-11) and neurofibrillary tau tangle pathology (Fig. 5d, BRAAK, R = 0.33, P = 4.2e-12) [54, 55]. We further characterized Msn expression via immunohistochemistry and observed a morphological difference between control and AD brain sections (Fig. 5e). Msn immunoreactive cells in the control brain showed a typical, ramified microglial morphology (Fig. 5e, Control inset), while Msn immunoreactive cells resembled activated microglia in the AD brain (Fig. 5e, AD inset). Lastly, we observed Msn immunofluorescent cells to be surrounding Aβ plaques in AD brain (Fig. 5f), similar to what we observed in the 5xFAD mouse brain (Fig. 3b).

Moesin is a hub protein of an AD-associated proteomic module with increased expression in the human AD brain. een Msn was identified as a hub of a microglial-enriched protein module identified by weighted co-expression network analysis (WGCNA) of proteomic data from controls, asymptomatic AD, and AD human post-mortem brain (dorsolateral prefrontal cortex) [40]. The top 100 proteins by module eigenprotein correlation value (kME) in the M4 module are shown. The size of each circle indicates the relative kME. Red circles indicate known microglia-enriched proteins identified in the current proteomic analysis. B Normalized relative Msn protein abundance in controls (N = 91), AsymAD (N = 98), and AD cases (N = 231) human post-mortem brains. Protein abundance data obtained from a published proteomic dataset [40]. One-way ANOVA, Tukey post hoc analysis: ***P < 0,001. C. Normalized Msn mRNA expression in controls (N = 157) and AD (N = 308) human post-mortem brains (dorsolateral prefrontal cortex). RNA expression data obtained from a published dataset [41]. Unpaired t-test: ***P < 0,001. NS Scatterplots displaying correlation between Msn protein abundance in human post-mortem brain and cognitive function (MMSE, mini-mental status examination score, higher scores represent better cognitive function) of control (N = 26), AsymAD (N = 28), and AD (N = 83) cases, amyloid-beta (Aβ) plaque burden (CERAD, Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s disease Aβ plaque score, higher scores represent greater plaque burden) in control (N = 91), AsymAD (N = 98), and AD (N = 230) cases, and tau tangle extent (Braak, tau neurofibrillary tangle staging score, higher scores represent greater extent of tangle burden) in control (N = 91), AsymAD (N = 98), and AD (N = 230) cases. Correlation coefficient (R) and significance of the association are shown. e Representative immunohistochemical images of control (N = 10) and AD (N = 10) post-mortem human brains (frontal cortex) stained with Msn. The inset, indicated by arrowhead, displays a high magnification of the Msn positive cells with ramified microglial morphology in control brain and activated microglial morphology in AD brain. Scale bar = 40 μm. F Representative immunofluorescence images of human AD brain (frontal cortex) showing Msn (red) and Aβ (green). Scale bar = 50 μm

Using independent proteomic datasets, we examined Msn protein abundance in published human post-mortem brain cohorts which included a variety of neurodegenerative disease cases [40, 42]. Similar to our primary findings (Fig. 5b), Msn abundance was significantly increased in AD DLPFC compared to controls in an independent cohort (Supplemental Figure 5A, P < 0,001). Interestingly, we observed a significant elevation in Msn abundance in FTLD-TDP DLPFC compared to controls (Supplemental Figure 5A, P < 0.001) however, this elevation was not seen in ALS and PD/PDD brains (Supplemental Figure 5A). Next, we wanted to determine whether Msn levels were increased in a different brain region other than DLPFC thus we analyzed a proteomic analysis of the precuneus in control, AsymAD, and AD cases [40]. We chose this region because the precuneus is affected early in the course of AD, as shown by clinical, imaging, and pathological studies [56]. We found Msn to be significantly elevated in AD precuneus compared to control (Supplemental Figure 5B, P < 0.01) and asymptomatic (Supplemental Figure 5B, P < 0.05) cases. There was an elevation of Msn levels in AsymAD precuneus compared to controls, although it was not statistically significant. Lastly, since Msn expression is observed in microglia proximate to Aβ plaques in human AD and 5xFAD mouse brains, we sought to determine Msn protein abundance in a published proteomic analysis of laser-micro-dissected Aβ plaques from the hippocampus and adjacent entorhinal cortex of rapidly progressive AD (rpAD) and sporadic AD (spAD) cases [17]. We found Msn abundance to be significantly lower in rpAD cases compared to spAD cases (Supplemental Figure 5C, P < 0.001) showing that despite the observed increased Msn expression in AD, it appears to have a negative association with rapidly progressive AD.

In addition to exploring human proteomic datasets, we examined published TMT-MS and RNAseq data for Msn protein and transcript levels, respectively, in mouse models of AD pathology [43, 44]. Quantitative proteomics using TMT-MS was conducted on brains from WT, 5xFAD (Aβ pathology), JNPL3 (tau pathology), and a cross of 5xFAD and JNPL3 (Aβ & tau pathologies) mice at 4 months, 7 months, and 10 months of age. There was an age dependent increase in Msn protein abundance in the 5xFAD and 5xFAD/JNPL3 brains compared to age-matched WT brains (Supplemental Figure 6A, P < 0.001), while Msn protein abundance was unchanged in JNPL3 mice. We observed a similar age dependent increase in Msn transcript levels in 5xFAD brain compared to WT brains, with a significant increase at 12 months of age (Supplemental Figure 6B, P < 0,05). Overall, analysis of these independent human and mouse proteomic and transcriptomic studies increases the validity of our finding of increased Msn in human AD and highlights a potential novel role for Msn in FTLD-TDP pathology.


Choosing a cell sorting option to study the fate of bystander cells: FACS or MACS?

A coculture of mixed cell populations is often used as one of the approaches to study bystander effects in experimental oncology and radiobiology. In experimental oncology, the antitumor effect is achieved by killing of bystander cells in the presence of genetically modified cells that are doomed to die too (“suicide gene therapy”) ( 1 ). In radiobiology, cells that were hit by ionizing radiation can also affect bystander cells, a phenomenon known as “radiation-induced bystander effect” (RIBE). Depending on an experimental design, type of radiation, and cell line used, there is a variety of RIBEs: alterations in gene expression, sister chromatid exchanges, gene mutation, micronucleus formation, neoplastic transformation, cell death, increased cell proliferation, radioprotective adaptive response, and so forth (reviewed in Refs. 2 and 3 ). Using the mixed coculture of irradiated and unirradiated rat liver epithelial cells (WB-F344), we showed that direct cell-to-cell contact is required to induce the proliferative bystander response ( 4 , 5 ).

In mixed coculture experiments, however, sometimes it is hard to determine the fate of bystander cells (e.g., whether they die or survive if they survive, whether they are subjected to transformation). To resolve this issue, bystander cells should probably be isolated within 24 h after initiating a coculture with “targeted” cells to further examine their fate in separate cultures. There are two major cell separation techniques that can potentially be used for isolation of bystander cells: fluorescence-activated cell sorting (FACS) and magnetic-activated cell sorting (MACS) ( 6 ). To choose which one of these techniques is more suitable for sorting out bystander cells, it is important to understand the principle of each of them taking into account the type and structural peculiarities of cocultured cells (e.g., whether they are homotypic or heterotypic, or whether they are different in composition of surface antigens). Major differences in cell labeling and sorting protocols to be taken into account for isolation of bystander cells are presented in Table 1. An undoubted advantage of FACS over MACS is in that it does not necessarily separate cells based only on differences in the composition of their surface antigens (thus, homotypic cell populations could be separated). In addition, some of the new generation FACS machines equipped with cell sorting modules are capable of sorting out cells directly into multiwell culture plates (e.g., six-well plates), which is very convenient to plate single cells for the clonogenic cell survival assay ( 7 ). Compared with FACS, after sorting with MACS, cells have to be counted and manually plated into culture plates, a procedure that could take some time.

Facs Macs
1. “Targeted” cells should be fluorescently labeled before coculture with bystander cells.a a To minimize photosensitization of bystander cells during cell separation process, they should not be f luorescently labeled.
Fluorescence cell labeling is not required before coculture.
2. Cells can be separated after they were trypsinized (if needed) and washed. Cells cannot be separated unless one of the cocultured cell populations is magnetically labeled.
3. Cells can be separated despite the lack of differences in composition of their surface antigens. Cells can be separated based only on differences in composition of their surface antigens.
4. Bystander cells can automatically be plated for the clonogenic cell survival assay. Bystander cells cannot automatically be plated for the clonogenic cell survival assay.
5. FACS instruments are expensive. MACS instruments are inexpensive.
  • a To minimize photosensitization of bystander cells during cell separation process, they should not be f luorescently labeled.

Finally, to minimize an error in quantification of surviving fraction of sorted bystander cells, their plating efficiencies should be compared with plating efficiencies of sorted sham bystander cells that were cocultured with sham “targeted” cells. Although cell separation itself theoretically can affect cell survival, in our studies, control WB-F344 cells did not show significant difference between plating efficiencies of manually and FACS-plated cells that both were ≈60% (personal observation).


Positive selection versus negative selection of cells

Based on what is being retained or isolated, two types of selections are possible:

What is positive selection of cells and why is it important?

Positive selection selects the cells that need to be collected as the target population. The method uses magnetic particles with antibodies targeting a subpopulation of interest covalently bound to their surface. Once placed within the magnet, targeted cells migrate toward the magnet and are retained within the magnetic field while the unlabeled cells are drawn off and discarded. The targeted cells can then be collected and used in the desired application after removal from the magnetic field.

Positive cell selections yield excellent results with respect to purity, recovery, and viability of selected cells. However, depending on the cell type being selected and the surface antigen being targeted by the particle, positive selections can result in cells becoming activated or otherwise functionally altered. Even though the probability of activation is low, this magnetic particle-induced activation may be an issue if you specifically require purified yet unstimulated cells. In that case, you should consider negative selection for your cell separations.

What is negative selection of cells and why is it important?

Negative selection magnetically isolates cells that are not needed, while the target population of cells can be aspirated and collected prior to downstream application, such as cell sorting.

Enrichment by depletion or negative selection is used for research applications that require a cell population with high levels of purity and no antibody or particles bound to their surface.

In this procedure, all unwanted cells are first labeled with a cocktail containing monoclonal antibodies against antigens expressed by them. After washing away unbound antibody, a second-step reagent is used to magnetically label these cells. The labeled cells migrate to the magnet leaving in suspension a pure and untouched subpopulation of cells to be collected. A large percentage (>95%) of unwanted cell populations can be removed through negative selection. 1

Enrichment using negative selection is recommended for downstream single-cell multiomic analysis. Such pre-enrichment helps in minimizing manipulation of cells.