Informatie

Waarom gebruiken neuronen chemische signalering op synaptische knooppunten?


Wanneer een neuron vuurt, stuurt het een elektrisch signaal dat zeer snel door het axon naar beneden springt via de knooppunten van Ranvier. Op een synaptische kruising is chemische Brownse diffusiesignalering met receptoroppervlakte-eiwitten relatief traag en wordt vaak uitgebuit door gif en vatbaar voor toxines (aan de positieve kant is het de reden dat veel medicijnen werken). Het lijkt onjuist dat de evolutie hiervoor heeft gekozen in plaats van een alternatieve, snellere en meer directe elektrische interface.

Vraag. Waarom worden chemische synaptische interfaces gebruikt in hogere organismen op de synaptische kruising?


Dit is het coolste deel. Die synapsen zijn de reden dat de hersenen zo complex zijn! In principe heb je het eerste deel goed, de neuronen zijn sneller en ze zenden berichten van het ene uiteinde naar het andere. Het andere dat u hoeft te doen, is analyseren en berekenen. Signalen van meerdere neuronen worden via een chemische synaps in een enkele neuron ingevoerd. Evenzo is het omgekeerde waar: een enkele neuron kan meerdere synapsen voeden. Dus als we bijvoorbeeld lopen, kunnen receptoren die ons evenwicht bewaken dit naar onze bewuste en onbewuste geest voeden, maar ik vereenvoudig dit enorm. Wat onze hersenen doen, is honderden en duizenden informatiepoorten nemen, met waar de chemische synaps is en het type synaps en de receptoren en een miljoen andere dingen, de informatie slechts een klein beetje veranderen totdat het perfect is en die informatie vervolgens op een miljoen manieren verzenden het houdt van.

Het belangrijkste is dat dit remming mogelijk maakt. Het grootste deel van de hersenen gebruikt remmende GABA in plaats van activerende signalen. Verder maakt het systeem gebruik van de gecreëerde vertraging. Verschillende zenders werken voor verschillende duur en verzenden een ander signaalvolume. Een impuls is alles of niets, het heeft een vaste amplitude, maar een chemisch signaal kan nauwkeurig worden afgestemd. Neuronen kunnen niet alleen interageren om zichzelf of andere neuronen te remmen om de resolutie van een signaal enz. te verhogen. Omgekeerd laat een systeem van alleen fysieke verbindingen weinig regulering toe, in feite zou het praktisch een aanval zijn.

Slaat dat ergens op?


Er zijn zowel chemische als elektrische synapsen in veel organismen. De elektrische synapsen worden gap junctions genoemd.

Zoals je aangeeft, is het belangrijkste voordeel van gap junctions hun snelheid, en ze worden vaak gebruikt in systemen met defensieve reflexen.

Zoals AndroidPenguin echter aangeeft, zorgen chemische synapsen voor grotere rekenvaardigheden (veranderen van de versterking, integreren van meerdere ingangen, enz.). Gap junctions zijn ook nadelig omdat ze vaak (maar niet altijd) signalen in beide richtingen uitzenden; chemische synapsen hebben de neiging meer unidirectioneel te zijn (natuurlijk is er altijd terugpropagatie).


Er zijn inderdaad 'gap junctions' die stroom rechtstreeks van de ene cel naar de andere doorgeven. Dus welke voordelen halen we uit chemische synapsen die gap junctions niet bieden?

  1. Asymmetrie. Synapsen werken niet omgekeerd, dus de postsynaptische cel kan geen stromen genereren in de presynaptische terminal (hoewel er secundaire vormen van communicatie zijn die in de omgekeerde richting kunnen werken).
  2. Ionenselectiviteit. Met een synaps kan een set ionenstromen worden omgezet in een andere set. Dus natrium- en calciuminstroom aan de presynaptische terminal kan zich vertalen in chloride-instroom om de synaps remmend te maken. Bovendien is het vermogen van de postsynaptische cel om calciumniveaus te regelen van cruciaal belang voor plasticiteitsmechanismen.
  3. Isolatie. Gap junctions verhogen de geleidbaarheid van het celmembraan, wat de betrouwbaarheid van signalen kan verminderen terwijl ze zich langs de dendriet voortplanten. Daarentegen kan een inactieve synaps vrijwel geen effect hebben op de postsynaptische cel - het laat geen stromen door.
  4. kinetiek. Omdat chemische synapsen hun eigen ionenstromen genereren, zijn ze ook vrij om de snelheid van die stromen (hoe snel ze stijgen en dalen). Bij gap junctions is dit veel moeilijker te realiseren.

Er is een zeer lange lijst met functionaliteit die alleen wordt geboden door synapsen die ik hier niet heb genoemd, maar ik denk dat de meeste daarvan dingen zijn die in principe ook kunnen worden bereikt met gap junctions (bijvoorbeeld: amplituderegeling, metabole reacties, korte - en lange termijn plasticiteit).


Waarom gebruiken neuronen chemische signalering op synaptische knooppunten? - Biologie

Een abonnement op J o VE is vereist om deze inhoud te bekijken. U kunt alleen de eerste 20 seconden zien.

De JoVE-videospeler is compatibel met HTML5 en Adobe Flash. Oudere browsers die HTML5 en de H.264-videocodec niet ondersteunen, gebruiken nog steeds een op Flash gebaseerde videospeler. We raden aan om de nieuwste versie van Flash hier te downloaden, maar we ondersteunen alle versies 10 en hoger.

Mocht dat niet helpen, laat het ons dan weten.

Neuronen communiceren met elkaar en met andere cellen, voornamelijk via chemische signalering bij synapsen. Deze gespecialiseerde regio's zijn waar het axonuiteinde van de presynaptische cel, het neuron dat het bericht verzendt, de postsynaptische cel ontmoet die het bericht ontvangt.

Het signaal bestaat uit neurotransmittermoleculen die zijn opgeslagen in het axonuiteinde in membraangebonden organellen die synaptische blaasjes worden genoemd.

Wanneer een elektrisch signaal, bekend als een actiepotentiaal, optreedt in het presynaptische neuron, zorgt dit ervoor dat deze blaasjes samensmelten met het celmembraan. Wanneer de blaasjes samensmelten, geven ze hun neurotransmitter af in de synaptische spleet, de nauwe ruimte tussen cellen.

De neurotransmitter diffundeert vervolgens over en bindt aan zijn postsynaptische receptoren. Deze binding lokt een reactie uit in de postsynaptische cel, die in dit geval een neuron is, en er kan een actiepotentiaal worden geproduceerd. Uiteindelijk zorgt synaptische signalering ervoor dat neuronen informatie naar andere cellen kunnen verzenden, dichtbij en veraf.

6.7: Synaptische signalering

Neuronen communiceren op synapsen, of knooppunten, om de activiteit van andere neuronen of doelcellen, zoals spieren, op te wekken of te remmen. Synapsen kunnen chemisch of elektrisch zijn.

De meeste synapsen zijn chemisch. Dat betekent dat een elektrische impuls&mdashor actiepotentiaal&mdash de afgifte van chemische boodschappers stimuleert. Deze chemische boodschappers worden ook wel neurotransmitters genoemd. Het neuron dat het signaal verzendt, wordt het presynaptische neuron genoemd. Het neuron dat het signaal ontvangt, is het postsynaptische neuron.

Het presynaptische neuron vuurt een actiepotentiaal af dat door zijn axon reist. Het uiteinde van het axon, of axonuiteinde, bevat met neurotransmitters gevulde blaasjes. De actiepotentiaal opent spanningsafhankelijke calciumionkanalen in het axonterminale membraan. Ca 2+ gaat snel de presynaptische cel binnen (vanwege de hogere externe Ca 2+-concentratie), waardoor de blaasjes kunnen fuseren met het terminale membraan en neurotransmitters vrijgeven.

De ruimte tussen presynaptische en postsynaptische cellen wordt de synaptische spleet genoemd. Neurotransmitters die vrijkomen uit de presynaptische cel vullen snel de synaptische spleet en binden aan receptoren op het postsynaptische neuron. De binding van neurotransmitters veroorzaakt chemische veranderingen in het postsynaptische neuron, zoals het openen of sluiten van ionkanalen. Dit verandert op zijn beurt het membraanpotentiaal van de postsynaptische cel, waardoor het min of meer waarschijnlijk is dat een actiepotentiaal wordt afgevuurd.

Om signalering te beëindigen, worden neurotransmitters in de synaps afgebroken door enzymen, opnieuw geabsorbeerd door de presynaptische cel, weg gediffundeerd of geklaard door gliacellen.

Elektrische synapsen zijn aanwezig in het zenuwstelsel van zowel ongewervelde als gewervelde dieren. Ze zijn smaller dan hun chemische tegenhangers en brengen ionen rechtstreeks tussen neuronen over, waardoor het signaal sneller kan worden verzonden. In tegenstelling tot chemische synapsen, kunnen elektrische synapsen echter geen presynaptische signalen versterken of transformeren. Elektrische synapsen synchroniseren neuronactiviteit, wat gunstig is voor het beheersen van snelle, onveranderlijke signalen zoals het gevaar dat ontsnapt in inktvissen.

Neuronen kunnen signalen verzenden naar en ontvangen van vele andere neuronen. De integratie van talrijke inputs die door postsynaptische cellen worden ontvangen, bepaalt uiteindelijk hun actiepotentiaalvurenpatronen.

Kennedy, Mary B. & ldquo Synaptische signalering in leren en geheugen. & rdquo Cold Spring Harbor-perspectieven in de biologie 8, nee. 2 (februari 2016). [Bron]


Paracriene signalering

Signalen die lokaal werken tussen cellen die dicht bij elkaar liggen, worden paracriene signalen genoemd. Paracriene signalen bewegen door diffusie door de extracellulaire matrix. Dit soort signalen lokken meestal snelle reacties uit die slechts een korte tijd duren. Om de respons gelokaliseerd te houden, worden paracriene ligandmoleculen normaal gesproken snel afgebroken door enzymen of verwijderd door naburige cellen. Door de signalen te verwijderen, wordt de concentratiegradiënt voor het signaal hersteld, waardoor ze snel door de intracellulaire ruimte kunnen diffunderen als ze weer worden vrijgegeven.

Een voorbeeld van paracriene signalering is de overdracht van signalen over synapsen tussen zenuwcellen. Een zenuwcel bestaat uit een cellichaam, verschillende korte, vertakte uitlopers, dendrieten genaamd, die prikkels ontvangen, en een lange uitloper, een axon genaamd, die signalen doorgeeft aan andere zenuwcellen of spiercellen. De kruising tussen zenuwcellen waar signaaloverdracht plaatsvindt, wordt een synaps genoemd. Een synaptisch signaal is een chemisch signaal dat zich tussen zenuwcellen verplaatst. Signalen in de zenuwcellen worden gepropageerd door snel bewegende elektrische impulsen. Wanneer deze impulsen het einde van het axon bereiken, gaat het signaal verder naar een dendriet van de volgende cel door de afgifte van chemische liganden die neurotransmitters worden genoemd door de presynaptische cel (de cel die het signaal uitzendt). De neurotransmitters worden getransporteerd over de zeer kleine afstanden tussen zenuwcellen, die chemische synapsen worden genoemd. De kleine afstand tussen zenuwcellen zorgt ervoor dat het signaal snel kan reizen, waardoor een onmiddellijke reactie mogelijk is.

Afbeelding (PageIndex<1>): Synapsis: De afstand tussen de presynaptische cel en de postsynaptische cel & mdash, de synaptische kloof & mdashi genoemd, is erg klein en zorgt voor snelle diffusie van de neurotransmitter. Enzymen in de synaptische spleet breken sommige soorten neurotransmitters af om het signaal te beëindigen.


Neuromusculaire verbinding

Een zeer belangrijke synaps in de dierfysiologie wordt de neuromusculaire verbinding, Dit is het knooppunt tussen motorneuronen en skeletspieren, dus het wordt ook wel het myoneurale knooppunt genoemd. De volgende lijst schetst de volgorde van gebeurtenissen die betrokken zijn bij synaptische transmissie op de neuromusculaire junctie (in detail bekeken in het spierhoofdstuk).

  1. Een actiepotentiaal wordt geïnitieerd in het motorneuron en verspreidt zich langs het axon naar de synaptische bol.
  2. De synaptische bol depolariseert.
  3. Ca++ poorten openen zich in het neurolemma van de synaptische bulb.
  4. Ca++ influx veroorzaakt de exocytose van ACh uit de synaptische blaasjes.
  5. De ACh diffundeert door de synaptische spleet en bindt zich aan receptoren in het sarcolemma.
  6. Het ACh-receptorcomplex wordt gevormd.
  7. Het ACh-receptorcomplex zorgt ervoor dat natriumpoorten in het sarcolemma openen.
  8. Na+-ionen diffunderen in het sarcoplasma en het sarcolemma depolariseert. Als de drempel wordt bereikt, wordt een actiepotentiaal van de spiercellen gegenereerd.
  9. het enzym acetylcholinesterase (ACh-E) is aanwezig in de synapsspleet.
  10. De ACh-E hydroliseert de ACh (choline wordt opnieuw geabsorbeerd door het presynaptische neuron en de acetylgroep verlaat de spleet maar kan elders opnieuw worden gebruikt), zodat er slechts één spierstimulatie is voor elk neuronactiepotentiaal.

Methoden:

C. elegans cultuur en stammen

Alle wormen zijn gekweekt op agarplaten met een laag OP50 Escherichia coli bij 21 ° C in een milieukamer. De wormstammen die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan ​​vermeld in tabel 1.

Genexpressiepatroonanalyses

Om dat te bevestigen: lgc-46 en acr-14 worden uitgedrukt in A-MN's, we hebben mStrawberry tot co-expressie gebracht onder de controle van Punc-4 (A-MN-specifiek) en GFP onder controle van ofwel Plgc-46 of Pacr-14. Om te bevestigen dat AVA-interneuronen cholinerge neuronen zijn, hebben we eerst een geïntegreerde transgene stam gemaakt die GFP tot expressie brengt onder de controle van Punc-17 (ZW798), en vervolgens gecoïnjecteerd twee plasmiden, pNP259 (Pgpa-14::Cre) en wp1392 (Pflp-18::loxP::LacZ::STOP::loxP::mStrawberry) in de ZW798-stam. Het gebruik van Pgpa-14 en Pflp-18 in Cre-loxP recombinatie resulteert in AVA-specifieke genexpressie30. De expressiepatronen van GFP en mStrawberry werden onderzocht en afgebeeld met een omgekeerde microscoop (TE-2000U, Nikon) uitgerust met specifieke fluorescentiefilters (HQ Texas Red/41004 en HQ FITC/41001, Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT, VS. ) en een CCD-camera (F-View II, Olympus). Pflp-18 en Pgpa-14 waren geschenken van Alexander Gottschalk lab 30 . De andere promotors, waaronder Punc-4 (2,9 kb), Pacr-14 (3,8 kb), Plgc-46 (3,0 kb) en Punc-17(4,1 kb), werden gekloneerd met behulp van genomisch DNA van de Bristol N2-stam als de matrijs en de primers vermeld in Tabel 2.

Reddingsexperimenten

lgc-46 en acr-14 mutanten werden gered door wildtype LGC-46 en ACR-14 tot expressie te brengen onder de controle van ofwel de natieve promotor of de A-MN-specifieke Punc-4. Volledige lengte lgc-46 (Y71D11A.5) cDNA en acr-14 (T05C12.2) cDNA werd gekloneerd uit een Bristol N2 cDNA-bibliotheek met behulp van de primers vermeld in Tabel 2.

RNA-interferentie

Neuron-specifieke gen-knockdown werd bereikt door het tot co-expressie brengen van twee plasmiden die coderen voor sense en het corresponderende antisense-RNA-fragment van een gen onder de controle van een specifieke promotor 62 . A-motorneuron-specifieke gen-knockdown werd bereikt met behulp van Pniet-4, terwijl AVA-specifieke gen-knockdown door a Cre-LoxP benadering met behulp van Pflp-18 en Pgpa-14 (ref. 30). De primers die worden gebruikt voor het klonen van de cDNA-fragmenten van lgc-46 (585 bp), unc-17 (473 bp), unc-7 (485 bp) en unc-9 (397 bp) staan ​​vermeld in Tabel 2. Van elke soort werd willekeurig één transgene lijn gekozen voor elektrofysiologische en gedragsanalyses.

Auxine-geïnduceerde UNC-7-degradatie

Een DNA-fragment dat codeert voor codon-geoptimaliseerd degron 41 werd gesynthetiseerd (GenScript, Piscataway, NJ, VS) en ingevoegd in wildtype genoom met behulp van de Crispr / Cas9-benadering 42 om UNC-7 te taggen met degron aan de C-terminus. De gids-RNA-sequentie (5'-GGATGCGGAACACGGTCAA) gericht op het laatste exon van unc-7 werd ingevoegd in pDD162 (Peft-3::Cas9+Empty sgRNA) (Addgene #47549) door plaatsgerichte mutagenese. Het resulterende plasmide (wp1685) werd gecoïnjecteerd met de transgene marker Pmyo-2::mAardbei (wp1613) in wildtype wormen. Genoom-bewerkte wormen werden geïdentificeerd door middel van PCR-screening en DNA-sequencing. De Cre-LoxP systeem werd gebruikt om AVA-specifieke afbraak van UNC-7 te bereiken. De TIR1::mRuby-sequentie werd geamplificeerd uit pLZ31 (Peft-3::TIR1::mRuby::unc-54 3′UTR, pCFJ151) (Addgene #71720) en gekloond in Pflp-18::loxP::LacZ::STOP::loxP::mStrawberry (wp1392) om P . te genererenflp-18::loxP::LacZ::STOP::loxP::TIR1::mRuby (wp1693). Dit plasmide werd gecoïnjecteerd met Pgpa-14::Cre (pNP259) en Pflp-18::loxP::LacZ::STOP::loxP::mCherry::SL2::GFP (wp1383) in de UNC-7 degron-stam. Voor auxine-geïnduceerde UNC-7-afbraak werden L4-transgene wormen overgebracht naar NGM-platen die 1 mM auxine bevatten, en de volwassen wormen werden de volgende dag gebruikt voor elektrofysiologische opname.

C. elegans elektrofysiologie

Alle elektrofysiologische experimenten werden uitgevoerd met volwassen hermafrodieten. Een dier werd geïmmobiliseerd op een glazen dekglaasje door Vetbond Tissue Adhesive (3M Company, St Paul, MN) aan te brengen. Het aanbrengen van de lijm was over het algemeen beperkt tot het dorsale voorste deel van het dier, waardoor de staart vrij kon zwaaien tijdens het experiment. Een korte (∼ 300 m) longitudinale incisie werd gemaakt langs het gelijmde gebied. Na het leegmaken van de ingewanden door middel van zuiging door een glazen pipet, werd de cuticula-flap teruggevouwen en vastgelijmd aan het dekglaasje, waardoor verschillende ventrale lichaamswandspiercellen, een klein aantal motorneuronen voor de vulva en enkele neuronen in het hoofd werden blootgesteld. Het ontlede wormpreparaat werd gedurende 10-15 s behandeld met collagenase A (Roche Applied Science, catalogusnummer 10103578001, 0, 5 mg ml ) en geperfuseerd met de extracellulaire oplossing voor een 5 tot 10-voudig badvolume. Pipetten van borosilicaatglas werden gebruikt als elektroden voor spannings- en stroomklemopnames. De weerstand van de pipetpunt voor opname van neuronen was ∼ 20 MΩ, terwijl die voor opname van lichaamswandspiercellen 3-5 MΩ was. Klassieke hele celconfiguratie werd verkregen door een negatieve druk uit te oefenen op de opnamepipet. Motorneuronen werden geïdentificeerd op basis van hun anatomische locaties, terwijl AVA op basis van GFP-fluorescentie van de expressie van een geïntegreerd transgen, dat werd gecreëerd met behulp van twee promotors en de Cre-LoxP benadering zoals hierboven beschreven, en gekruist in verschillende mutanten. Spontane en opgewekte PSC's op de neuromusculaire overgang werden geregistreerd en geanalyseerd zoals eerder beschreven 63 . Spannings- en stroomklemexperimenten werden uitgevoerd met een Multiclamp 700B-versterker (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, VS) en de Clampex-software (versie 10, Molecular Devices). Gegevens werden gefilterd op 2 kHz en bemonsterd op 10 kHz. Postsynaptische stromen en exogene neurotransmitter/agonist-geïnduceerde stromen van hele cellen werden geregistreerd bij een houdspanning van -60 mV. Exogene neurotransmitters en agonisten werden aangebracht door middel van drukuitstoot door een glazen pipet met behulp van een Picospritzer III (Parker Hannifin, Hollis, NH) met een druk ingesteld op 10 pSi en een pulsduur van 30 ms. De extracellulaire oplossing bevatte (in mM) NaCl 140, KCl 5, CaCl2 5, MgCl2 5, dextrose 11 en HEPES 5 (pH 7,2). De pipetoplossing bevatte (in mM) 120 KCl, 20 KOH, 5 Tris, 0,25 CaCl2, 4 MgCl2, 36 sucrose, 5 EGTA en 4 Na2ATP (pH 7,2) behalve die gebruikt voor het opnemen van PSC-uitbarstingen van lichaamswandspiercellen, die (in mM) 6,8 KCl, 113,2 Kgluconaat, 20 KOH, 5 Tris, 0,25 CaCl bevatten2, 4 MgCl2, 36 sucrose, 5 EGTA en 4 Na2ATP (pH 7,2).

Xenopus eicel expressie

Eicellen werden verkregen van wildtype Zuid-Afrikaanse klauwkikkers (Xenopus Express, Brooksville, FL) volgens een protocol dat is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van UConn Health. Afgetopt cRNA van lgc-46 werd gesynthetiseerd met behulp van een T3 mMessage mMachine Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, VS) en geïnjecteerd in ontfolliculeerde eicellen (∼ 50 nl per eicel bij 1,0 ng nl 1) met behulp van een Drummond Nanoject II-injector (Drummond Scientific, Broomall, PA , VS). Hele-celopnames met twee elektroden werden 4-5 dagen na cRNA-injectie uitgevoerd met behulp van een oöcyt-klemversterker (OC-725C, Warner Instruments, Hamden, CT, VS) en de Clampex-software. De houdspanning was −60 mV. Gegevens werden gefilterd op 1 kHz en bemonsterd op 10 kHz. In elk experiment werd een enkele eicel in een eicelperfusiekamer (AutoMate Scientific, Berkeley, CA, VS) geplaatst die ND96-oplossing bevat (samenstellingen in mM: 96 NaCl, 2,0 KCl, 1,8 CaCl2, 1,0 MgCl2, 5,0 HEPES, pH 7,2). Kandidaat-agonisten werden via een microverdeelstuk (AutoMate Scientific) in de oöcytperfusiekamer geperfuseerd. Een 8-kanaals perfusiecontroller (Valvelink8.2, AutoMate Scientific) werd gebruikt voor perfusie, waarbij de kleppen werden bestuurd door pClamp.

Ca2+ beeldvorming

Jonge volwassen wormen van een geïntegreerde stam die GCaMP2 tot expressie brengt in lichaamswandspiercellen 54 werden gelijmd en gefileerd voor beeldvorming van spontane fluorescentieveranderingen van lichaamswandspiercellen met behulp van een elektronenvermenigvuldigende CCD-camera (iXonEM+885, Andor Technology, Belfast, Noord-Ierland ), een FITC-filterset (59222, Chroma Technology Corp.), een lichtbron (Lambda XL, Sutter Instrument, Novato, CA, VS) en de NIS-Elements-software (Nikon). Afbeeldingen werden verkregen met 16 frames per seconde met een belichtingstijd van 10-40 ms (geen binning) gedurende 3 minuten. TTL-signalen van de camera werden gebruikt om de opnames van Ca2+-transiënten en PSC's te synchroniseren.

Optogenetische stimulatie

Wormen van een geïntegreerde stam die channelrhodopsine-2 tot expressie brengt in commando-interneuronen onder controle van Pglr-1 (ref. 16) werden gekweekt tot L1-L2-stadium op standaard wormkweekplaten en vervolgens twee dagen voor het experiment overgebracht naar nieuwe platen met of zonder (voor negatieve controle) all-trans-retinaal. De retinale platen werden bereid door elke plaat (60 mm diameter met 10 ml agar) te spotten met 200 μl OP50 E coli met 2 mM retina (R2500, Sigma-Aldrich). Fotostimulatie werd toegepast via een 40X wateronderdompelingsobjectief in pulsen van 2 s met intervallen van 30 s met behulp van een lichtbron (Lambda XL met SlimShutter, Sutter Instrument) en een excitatiefilter van 470 ± 20 nm (59222, Chroma Technology Corp.). De gemeten lichtintensiteit op de positie van het monster was 6,7 mW mm 2, wat voldoende was om maximale evoked peak-responsen te veroorzaken 16 .

Metingen van achterwaartse voortbeweging

Achterwaartse voortbeweging als reactie op hoofdaanraking door een platinadraad werd getest met L4-stadiumwormen. Het aantal dorsoventrale staartzwaaien als reactie op elke aanraking werd geteld door de onderzoeker met een stereomicroscoop (SMZ-800, Nikon). Eén onderzoeker (B.C.) bereidde de wormstammen voor, terwijl een andere (P.L.) de voortbewegingstest uitvoerde zonder de stamgenotypen te kennen.

Chemicaliën

Acetylcholine (AC159170050, ACROS Organics), GABA (AC103280250, ACROS Organics), aspartaat (11240, Sigma-Aldrich), ATP (A3377, Sigma-Aldrich), dopamine (H8502, Sigma-Aldrich), glutamaat (49621, Sigma-Aldrich ), octopamine (O0250, Sigma-Aldrich), serotonine (H9523, Sigma-Aldrich), tyramine (T2879, Sigma-Aldrich), nicotine (AC181420050, ACROS Organics), levamisol (AC187870100, ACROS Organics), choline (AC110295000, ACROS Organische stoffen), glycine (G46-1, Fisher Scientific), d-tubocurarine (T2397, Sigma-Aldrich), gabazine (S106, Sigma-Aldrich) en histamine (H7250, Sigma-Aldrich) werden eerst opgelost in water om bevroren voorraadoplossingen (10 tot 100 mM), die vóór gebruik werden verdund tot eindconcentraties met behulp van extracellulaire oplossingen.

Gegevensanalyses

De duur en ladingsoverdracht van PSC-bursts werden gekwantificeerd met Clampfit-software (versie 10, Molecular Devices) zoals eerder beschreven 16 . De frequentie van PSC-bursts werd handmatig geteld. Amplitudes van junctionele stroom en membraanspanning werden gekwantificeerd op basis van de gemiddelde amplitude gedurende de laatste 100 ms bij elke spanningsstap (250 ms) of stroominjectiestap (1.000 ms) met behulp van pClamp. Calciumbeeldvormingsgegevens werden geanalyseerd zoals eerder beschreven 54 . Gegevensgrafieken en statistische analyses werden uitgevoerd met Origin Pro 2015 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± s.e. Ofwel ANOVA (met Tukey's HSD-test) of ongepaard t-test werd gebruikt voor statistische vergelijkingen zoals gespecificeerd in figuurlegenda's. P<0,05 wordt als statistisch significant beschouwd. De steekproefomvang (N) is gelijk aan het aantal geregistreerde cellen of celparen, of het aantal wormen dat wordt gebruikt in voortbewegingsanalyses.

Beschikbaarheid van data

Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel en de bijbehorende aanvullende informatiebestanden.


Geneesmiddelen die werken in synaptische spleet

Zoals eerder gezegd, fungeert de synaptische spleet als een plaats van
werking van verschillende medicijnen. Deze medicijnen omvatten het volgende.

Curare-medicijn

Het is een medicijn dat de werking van acetylcholine stopt bij postsynaptische neuron. Het is een niet-depolariserende spierverslapper die de activering van acetylcholinereceptoren blokkeert. Het werkt via de synaptische spleet en voorkomt depolarisatie van postsynaptische neuronen.

Strychnine

Het is een giftig medicijn dat voornamelijk inwerkt op motorneuronen
in het ruggenmerg. Het werkt via de synaptische spleet en blokkeert de
activering van acetylcholine- en glycine-receptoren waardoor ongecontroleerde spier
spasme. Het wordt gebruikt als een neurotoxine.

Morfine

Het is een bekende pijnstiller en kalmerend middel. Het werkt via synaptische spleet en activeert de mu-receptoren op postsynaptische neuronen.

Acetylcholine-esteraseremmers

Deze medicijnen verminderen het acetylcholine-enzym dat aanwezig is in de synaptische spleet. Hierdoor voorkomen ze de degradatie van acetylcholine. Deze geneesmiddelen worden geclassificeerd als indirect werkende muscarine-agonisten. Ze omvatten physostigmine, pyridostigmine, neostigmine, enz.

Alcohol

Alcohol bindt aan GABAEEN receptoren en
verhogen de remmende effecten van GABA. Het werkt ook via de synaptische
gespleten.

Conclusie/Samenvatting

Synaptische spleet is een ruimte tussen twee neuronen, die ze met elkaar verbindt en een synaps vormt.

Het is aan één kant gebonden door pre-synaptische neuron en
hebben postsynaptische neuron aan de andere kant. Het presynaptische neuron is altijd
een axonuiteinde. Afhankelijk van het type synaps, het postsynaptische neuron
misschien

  • Een axon, zoals in axo-axonische synaps
  • Dendriet in axo-dendritische synaps
    of
  • Cellichaam of soma, zoals in
    axo-somatische synapsen

Wanneer een zenuwimpuls het presynaptische uiteinde bereikt, veroorzaakt het de afgifte van neurotransmitters in de synaptische spleet. Deze neurotransmitters diffunderen door de synaptische spleet en binden aan de receptoren op postsynaptische neuronen.

Dit veroorzaakt de overdracht van zenuwimpulsen van pre-synaptische naar postsynaptische neuron.

Functies uitgevoerd door synaptische spleet omvatten:

  • Diffusie van neurotransmitters
  • Afbraak van neurotransmitters
  • Regulering van zenuwimpuls
    overdragen
  • Site van drugsactie

Wijzigingen in overdracht van zenuwimpulsen is in verband gebracht met een aantal aandoeningen, waaronder:


INVOERING

De functie van het zenuwstelsel wordt bepaald door verbindingen tussen specifieke neuronen. Deze verbindingen omvatten chemische synapsen die neurotransmitters gebruiken om postsynaptische reacties op te roepen en gap junctions die de ionenstroom tussen gekoppelde neuronen reguleren. Hoewel er enige vooruitgang is geboekt in het begrijpen van de moleculaire basis van chemische synaptische specificiteit (Sanes en Yamagata, 2009 Shen en Scheiffele, 2010), is er weinig bekend over hoe neuronen partners kiezen voor de assemblage van gap junction (Bennett en Zukin, 2004 Hestrin en Galarreta, 2005). Beide typen synapsen zijn actief in motorcircuits die lichaamsbewegingen reguleren (Charlton en Gray, 1966 Westerfield en Frank, 1982 Van Der Giessen et al., 2008 Li et al., 2009). De sleutelrol van transcriptiefactorcodes in het lot van motorische neuronen suggereert dat genetische programma's de specificiteit van deze verbindingen bepalen (Briscoe et al., 2000 Shirasaki en Pfaff, 2002). Stroomafwaartse doelen met rollen in synaptische specificiteit zijn grotendeels onbekend, maar omvatten waarschijnlijk een combinatie van diffundeerbare signalen en celoppervlakte-eiwitten die synaptogene reacties reguleren (Pecho-Vrieseling et al., 2009).

Wnt-signalering functioneert als een belangrijke regulator van synaptische assemblage in de hersenen en op de neuromusculaire kruising (Budnik en Salinas, 2011). In cerebellaire neuronen activeert Wnt7a bijvoorbeeld een cytoplasmatische route die lokale assemblage van presynaptische componenten bevordert, terwijl Wnt-afhankelijke synaptische assemblage aan de Drosophila neuromusculaire junctie kan ook afhankelijk zijn van transcriptionele regulatie (Packard et al., 2002 Ahmad-Annuar et al., 2006 Ataman et al., 2006 Miech et al., 2008). Wnts kunnen ook fungeren als antagonistische signalen om synapsvorming te beperken (Inaki et al., 2007 Klassen en Shen, 2007) en, in ten minste één geval, tegengestelde rollen aannemen die synaptogenese bevorderen of remmen (Davis et al., 2008). Hoewel meerdere leden van de Wnt-familie tot expressie komen in het zich ontwikkelende ruggenmerg en is aangetoond dat ze de baan van axonen en het lot van neuronen reguleren, zijn er geen expliciete rollen in synaptogenese ontdekt (Lyuksyutova et al., 2003 Liu et al., 2005 Agalliu et al. ., 2009). Hier beschrijven we onze bevinding dat tegengestelde Wnt-signaleringsroutes de specificiteit van synaptische inputs in een nematodenmotorcircuit reguleren.

In C. elegans, achterwaartse beweging hangt af van verbindingen tussen AVA-interneuronen en VA-klasse motorneuronen, terwijl voorwaartse voortbeweging AVB-invoer vereist voor VB-motorneuronen (Fig. 1) (Chalfie et al., 1985 Ben Arous et al., 2010 Haspel et al., 2010 ). De specificiteit van deze verbindingen wordt gecontroleerd door de UNC-4 homeodomein transcriptiefactor, die functioneert in VA-motorneuronen (Miller et al., 1992). In unc-4 mutanten, worden AVA-invoer naar VA's vervangen door gap junctions van AVB en wordt de achterwaartse voortbeweging verstoord. De karakteristieke anterieure polariteit van VA-motorneuronen is echter niet verstoord, wat suggereert dat UNC-4 de specificiteit van synaptische inputs reguleert, maar niet andere eigenschappen die VA's onderscheiden van zuster-VB-motorneuronen (White et al., 1992 Miller en Niemeyer, 1995 ). UNC-4 functioneert als een transcriptionele repressor met het geconserveerde Groucho-achtige eiwit UNC-37 om de expressie van VB-specifieke genen te blokkeren (Pflugrad et al., 1997 Winnier et al., 1999) (Fig. 3). We hebben aangetoond dat een van deze VB-eiwitten, de HB9 (MNX1) homoloog CEH-12, voldoende is om VA-motorneuronen opnieuw te bedraden met VB-type inputs (Von Stetina et al., 2007b). Deze bevindingen onthulden dus een regulerende omschakeling waarbij differentiële expressie van de transcriptiefactoren, UNC-4 versus CEH-12, in VA's resulteert in alternatieve sets van presynaptische inputs. Dit mechanisme vertoont echter regionale specificiteit langs de lengte van het ventrale zenuwkoord. ectopische expressie van ceh-12 in unc-4 mutanten is beperkt tot posterieure VA-motorneuronen en de specificiteit van VA-invoer op deze locatie hangt af van ceh-12. Deze bevindingen suggereren dat UNC-4 meerdere doelen zou kunnen reguleren die parallel functioneren om inputs voor geselecteerde VA-motorneuronen in verschillende ventrale koorddomeinen te specificeren (Von Stetina et al., 2007b). Hier melden we de ontdekking dat ceh-12 expressie in posterieure VA-motorneuronen wordt geactiveerd door een specifiek Wnt-eiwit, EGL-20, dat wordt uitgescheiden door aangrenzende cellen in dit gebied. We stellen voor dat UNC-4 normaal gesproken voorkomt dat VA's reageren op EGL-20 door een canonieke Wnt-signaleringsroute te antagoneren met behulp van de Frizzled (Frz) -receptoren MOM-5 en MIG-1. We hebben ook een afzonderlijke Wnt-route geïdentificeerd, waarbij de Frz-receptor LIN-17 en de Wnt-liganden LIN-44 en CWN-1 betrokken zijn, die VA-invoer behouden door de expressie van CEH-12 in anterieure VA's te blokkeren. Onze resultaten hebben een sleutelrol blootgelegd voor de UNC-4-transcriptiefactor bij het moduleren van de relatieve sterktes van Wnt-signaleringsroutes met tegengestelde rollen in synaptische keuze. Het wijdverbreide voorkomen van regionale Wnt-signaleringssignalen in het zich ontwikkelende ruggenmerg zou een aanwijzing kunnen zijn voor vergelijkbare functies voor transcriptiefactoren bij het reguleren van synaptische specificiteit in het motorische circuit van gewervelde dieren.

Schema van de C. elegans motor neuron circuit. Interneuronen van het hoofd en de staart breiden axonen uit in het ventrale zenuwkoord om synapsen te maken met specifieke motorneuronen. Het voorwaartse circuit (rood) omvat AVB- en PVC-interneuronen en DB (niet getoond) en VB-motorneuronen. Het achterwaartse circuit (blauw) omvat AVA-, AVD- en AVE-interneuronen en DA (niet weergegeven) en VA-motorneuronen. VA's en VB's komen voort uit een gemeenschappelijke voorloper, maar zijn verbonden met afzonderlijke sets interneuronen (AVA en AVB getoond voor de eenvoud).

UNC-4 regelt de connectiviteit in het motorneuroncircuit. (EEN) UNC-4 functioneert met co-repressor UNC-37 om de expressie van het VB-gen CEH-12 te blokkeren en om VA-type inputs te behouden (blauw). (B) De-repressie van CEH-12 in posterieure VA's in unc-4 en unc-37 mutanten resulteert in de verkeerde bedrading van VA's met VB-type ingangen (rood) en verstoorde achterwaartse voortbeweging. EGL-20 bevordert de expressie van CEH-12. (C) Mutaties in ceh-12 ectopische verbindingen met AVB elimineren en het Unc-4-fenotype gedeeltelijk onderdrukken. (D-F) Locomotie-assays. ‘Unc’ dieren kunnen niet achteruit kruipen. ‘Onderdrukte’ wormen vertonen een detecteerbare achterwaartse beweging. ceh-12(gk391) en egl-20(n585) mutanten onderdrukken sterk het Unc-4-fenotype van hypomorfe allelen unc-4(e2323) en unc-37(e262) (D) en unc-4(e2322ts) (E). EEN mig-1(e1787) mutatie onderdrukt Unc-4 beweging gedeeltelijk (E). ceh-12 en egl-20 mutants partially suppress the null allele unc-4(e120) (F). * Pπ.05, ** Pπ.01, *** Pπ.0001. § Pπ.05 versus unc-4 egl-20. N�. N.S., not significant.


Types of Cell Signaling

The sequence of cell signaling remains is the same for most cell but depending on the distance separating two communicating cells, cell signaling can be classified into several different categories.

Cell signaling can be broadly classified into intracellular signaling and intercellular signaling. Intracellular signaling occurs within the cell in response to internal and external stimuli. In other words, it is simply when a cell is talking to itself and working independently. On the other hand, intercellular signaling is where a cell talks to the other cells of the body. In many cases, signaling might involve cells talking to themselves and to others in order to generate a response.

In the case of intercellular signaling, the type of signal can be further classified on the basis of the distance travelled.

Types of intracellular signaling (Photo Credit : CNX OpenStax/Wikimedia Commons)

Autocrine Signaling: Sometimes cells can produce signaling molecules that bind to receptors on their own membrane. In this way, it&rsquos possible for cells to send messages to themselves! Although it sounds strange, autocrine signaling is essential during development, as it ensures correct cell division and maintenance of cell identity. Think of it as setting reminders and writing notes to yourself it may seem weird, but it&rsquos necessary sometimes.

Direct-Contact Signaling: Some cells lie very close to each other and are in direct contact. Such cells have passages that connect them. For example, gap junctions in animal cells and plasmodesmata in plant cells are such passages that connect neighbouring cells. Signaling molecules can easily pass through these passages. This feature enables a group of cells to respond to a signal received by just one cell.

Paracrine Signaling: This form of communication takes place between cells that are near each other, but are not connected. In this case, the cells talk via the diffusion of chemical signaling molecules across short distances. Synaptic signaling between neurons (brain cells) is an example of paracrine signaling. Neurons release signaling molecules called neurotransmitters in the gap between themselves and the next neuron. This gap is known as a synapse. Hence, synaptic signaling allows our brain and central nervous system to work together by sending messages across multiple neurons.

Synaptic Signalling (Photo Credit : CNX OpenStax/Wikimedia Commons)

Endocrine Signaling: This is a method employed by cells that are far apart from each other . Like a package that is shipped internationally, signaling molecules may travel through the bloodstream to reach the target cell. Such molecules are called hormones . For example, the hormone adrenaline, released by the adrenal gland present atop the kidneys, is the fight or flight hormone. Adrenaline is released under stress and is responsible for increasing heart rate and blood pressure, redistributing blood to muscles, ramping up glucose production and much more. Hence, this hormone travels throughout the body from the adrenal gland via the bloodstream to the cardiac muscles to increase pumping, as well as to the liver for glucose production.


Resultaten

Loss of Bbs proteins affect principal neuron dendritic morphology

Given that primary cilia are required for the formation of neuronal dendrites [21], we investigated the effect of loss of ciliary Bbs proteins on the dendritic morphology of principal neurons of Bbs mouse models. We measured dendritic length, spine count, and spine density of dentate gyrus (DG), basolateral amygdala (BLA), and layer V pyramidal neurons of the frontal cortex using a Golgi-Cox impregnation method. We found that the total spine density was reduced by 55% in DG granule cells of P42 old Bbs4 −/− mice (Fig 1A and 1B and S1 Video). Total spine density on the basal and apical dendrites (further referred to as basal and apical spine density) of layer V neurons was reduced by 55% and 54% (Fig 1A and 1E), respectively, and total basal and apical spine density of BLA neurons was reduced by 23% and 22%, respectively (Fig 1A and 1J). Sholl analysis revealed a significant reduction in spine density of all branches and per 30-μm interval in DG with the exception of the most distal branch and a 300-μm circle in Bbs4 −/− mice (Fig 1C and 1D). Similar Sholl analysis results were found in apical and basal dendrites of Layer V neurons, where dendritic spine density per branch order and per 30-μm interval was affected (Fig 1F–1I). Apical and basal BLA dendrites of Bbs4 −/− mice revealed unequal patterns in spine reduction affecting only a few branches and concentric circles (Fig 1K–1N). A number of dendritic intersections in DG, Layer V, and BLA neurons were not affected when compared with control mice (S1A–S1E Fig). Total dendritic length was reduced by 48% in DG neurons and by 25% in basal dendrites of layer V cortex neurons in Bbs4 −/− mice. Change in the length of apical dendrites of layer V cortex neurons in Bbs4 −/− mice was not statistically significant. BLA apical and basal dendrites showed a statistically significant length reduction of 14% and 19%, respectively (S1F–S1J Fig). Overall, these data show significant aberrations in dendritic morphology in the Bbs mouse model.

(A) Representative images of Golgi-impregnated DG, BLA, and Layer V pyramidal neurons of P42 Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice (100x scale bar, 5 μm). (B-D) Spine density of DG neurons. (B) Total spine density. (C) Spine density per branch order. (D) Spine density per 30-μm interval. (E-I) Spine density of layer V pyramidal neurons. (E) Total spine density. (F) Spine density in apical dendrites per branch order. (G) Spine density in basal dendrites per branch order. (H) Spine density in apical dendrites per 30-μm interval. (I) Spine density in basal dendrites per 30-μm interval. (J-N) Total spine density of BLA. (J) Total spine density. (K) Spine density in apical dendrites per branch order. (l) Spine density in basal dendrites per branch order. (M) Spine density in apical dendrites per 30-μm interval. (N) Spine density in basal dendrites per 30-μm interval (Nmice/WT = 5 Nmice/KO = 7, Ncellen/WT = 25, Ncellen /KO = 35, mean ± SD, ***P < 0.001 **P < 0.01 *P < 0,05). One-way ANOVA, Tukey post hoc test except for B, E, J, where unpaired t test was used. Underlying data are available in S1 Data. Bbs4, Bardet-Biedl syndrome 4 BLA, basolateral amygdala DG, dentate gyrus KO, knockout ns, not significant WT, wild type.

To determine when the dendritic architecture of Bbs4 −/− DG neurons begins to change, we analysed dendritic length and spine density per branch order and per 30-μm interval at E19.5 and P21. The results of P21 were similar to those obtained at P42: we observed a significant reduction in dendritic length and spine density and no significant changes in a number of dendritic intersections (S2A–S2F Fig). By contrast, at E19.5, the density of dendritic filopodia (dendritic protrusions on developing neurons) in Bbs4 −/− DG neurons were not affected. However, the dendritic length was significantly reduced at E19.5 (S2A and S2G–S2K Fig). Taken together, the Bbs4 −/− murine model shows a progressive decrease in dendritic spine density at P21 (38%) and P42 (55%), but not at late embryonic stages (S2L Fig).

To investigate whether similar dendritic abnormalities can be detected in other Bbs models, we analysed the DG dendrite morphology of P21 Bbs5 en Bbs1 M390R models. Notably, loss of the Bbs5 protein led to significant reduction in DG dendritic length (34%) and overall spine density (32%) in dentate granule cells of knockout mice (S3A–S3C Fig). Sholl analysis also revealed abnormal spine density in Bbs5 −/− mice, with a significant spine reduction from the second to fifth branch order and from the 60-μm to 150-μm interval, respectively (S3D–S3F Fig). interessant, Bbs1 M390R/M390R was associated with consistent but marginal abnormalities in spinogenesis of DG neurons showing only a 10% reduction in the total spine density. However, dendritic length was not affected (S3A and S3G–S3K Fig). This finding is in agreement with our clinical observations that BBS1 M390R patients have the mildest cognitive phenotype.

To determine whether specific subtypes of spines were overrepresented on DG neurons of Bbs4 −/− mice, we analysed spines based on their size and shape (S4A Fig) [22]. We observed that total spine count was reduced in all spine subtypes except ‘branched’ spines. However, when the reduction of dendritic length of Bbs4 −/− neurons was taken into account, we found that only the density of ‘thin’ spines was significantly reduced (22%) (S4B–S4E Fig).

Reduced contextual and cued fear memory but no impairment in anxiety-like behaviour in Bbs4 −/− mice

Hippocampus, amygdala, and prefrontal cortex are structures involved in learning, memory, and social interaction. To investigate whether the loss of dendritic spines of DG, BLA, and prefrontal cortex neurons correlates with behavioural changes in Bbs4 −/− mice, we performed a set of behavioural tests. Bbs mice are known to develop a number of defects, including visual impairment and obesity [23]. To minimise the effect of these confounding factors, we performed the tests in younger mice (8 weeks). According to the majority of the literature and our own assessments, retinal degenerative changes in this Bbs4 model begin to develop at 7–8 weeks, making visual impairment unlikely to account for the differences in the test. Similarly, obesity should not confound our results, as at this age there are no weight differences in Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice. To assess fear memory, we performed contextual and cued fear conditioning tests. In the conditioning session at Day 1, freezing behaviour and distance travelled during the first 150 seconds without introducing a conditioned stimulus (tone) and unconditioned stimulus (footshock) were used to evaluate baseline activity in the novel environment of the contextual fear experiment. The loss of Bbs4 did not affect the percentage of freezing or distance travelled in baseline activity of Bbs4 −/− male and female mice. However, after introduction of the paired tone-foot shock stimulus at Day 1, post hoc analysis revealed a significant decrease in the percentage of freezing and an increase in the distance travelled on Day 2 of Bbs4 −/− female mice compared with female control mice. Percentage of freezing and an increase in distance travelled were not statistically significant in male mice (Fig 2A, 2B and 2D).

(A) Schematic presentation of the contextual and cued fear conditioning test. At Day 1, mice were placed in the fear conditioning chamber for 616.6 seconds. After 150 seconds, a 5-second tone is played, followed by a 0.5-second, 0.5-mA shock. The tone and shock are repeated two more times at 150-second intervals. At Day 2 mice were placed in exactly the same chamber for 300 seconds without tones or shocks. After 4 hours (Day 2), mice are placed in the altered context and left for 180 seconds. At 180 seconds, a 5-second tone is played, which is repeated twice at 60-second intervals. The first 150 seconds of the conditioning trial were used as a baseline for the context data. The first 180 seconds in the altered context were used as the baseline for the cue data. (B) Freezing (%) in the contextual memory test. (C) Freezing (%) in the cue memory test. (D) Distance travelled (cm) in the conditioning test, context test, and cued test (females: NWT = 11, NKO = 11 males: NWT = 13, NKO = 12 mean ± SD, ***P < 0.001 **P < 0.01 *P < 0,05). One-way ANOVA, Tukey post hoc test. # It was noted that there was a significant level of reduction of percent time freezing and distance travelled in Bbs4 −/− mice when unpaired, two-tailed t test (P < 0.05) was used. Underlying data are available in S3 Data. Bbs4, Bardet-Biedl syndrome 4 KO, knockout WT, wild type.

Altered context at Day 2 before the introduction of the tone was used as a baseline for the cue data. The data revealed that there was no significant change in the percentage of freezing in altered context baseline activity (Fig 2C and 2D). During the cued conditioning session with the tone (Day 2, 180–360 seconds), the percentage of freezing was significantly reduced, and distance travelled increased in Bbs4 −/− male but not in female mice (Fig 2C and 2D). This set of results indicates that loss of Bbs4 protein affects contextual and cued fear memory in a gender-task–dependent manner.

Miniature excitatory postsynaptic currents amplitude is increased in Bbs4 −/− DG neurons

The morphology of dendritic spines is highly dynamic, and their formation and maintenance depend on synaptic function and neuronal activity [24]. To assess synaptic and neuronal function in a Bbs model, we measured intrinsic and synaptic properties of hippocampal granule cells of 3–4-week-old Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice in acute hippocampal slices. We found that intrinsic properties of Bbs4 −/− neurons were unaffected compared with age-matched control littermates (Fig 3A–3C). To evaluate the synaptic properties of granule cells in these two groups, we measured miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). Notably, while the frequency of mEPSCs was not different between the two groups, mEPSC amplitudes were significantly larger in Bbs4 −/− neurons (Fig 3D–3F). These data make it unlikely that decreased neuronal activity underlies diminished spine density. On the contrary, the observed increase in mEPSC amplitudes suggests an activation of compensatory mechanisms at the presynaptic and/or postsynaptic sites in response to spine loss.

(A) Comparison of firing patterns in response to current injections during current clamp recordings from hippocampal granule cells. (B) Bar graphs summarising passive membrane properties. No significant differences were found between Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice in input resistance (left), membrane time constant (middle), and resting membrane potential (right). (C) Firing frequency was plotted against current injection amplitudes. No significant differences were found between Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice. (D) mEPSCs were recorded from hippocampal granule cells in Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice (N = 6). (E) Cumulative probability plot comparing mEPSC amplitudes between Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice. mEPSC amplitudes in granule cells of Bbs4 −/− mice are significantly larger (N = 6, P < 0.05, Kolmogorov-Smirnov test). (F) Cumulative probability plot comparing inter-event intervals (IEIs) of mEPSCs between Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice (N = 6 P = 0.27, Kolmogorov-Smirnov test). Underlying data are available in S3 Data. Bbs4, Bardet-Biedl syndrome 4 IEI, inter-event interval KS, Kolmogorov-Smirnov mEPSC, miniature excitatory postsynaptic current.

IGF-1R downstream signalling is dysregulated in Bbs4 −/− synaptosomes

A number of tyrosine kinase receptors (RTKs), including IGF, RET, TrkB, PDGF, and EphB are known to enhance dendritic growth and promote the formation and maintenance of dendritic spines [7,25]. To assess the signalling of RTK in the synaptosomal fractions of Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice, we quantified the phosphorylation level of RTKs using a Phospho-RTK Array. Given that dendritic spine loss occurs between P1 and P21 and to capture the initial signalling changes before potential compensatory mechanisms may start taking place, we used synaptosomal fractions of P7 mice. Synaptosomal fractions from Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice were incubated with the membrane containing immobilised RTK antibodies followed by detection of RTK phosphorylation by a pan anti-phospho-tyrosine antibody. Interestingly, phosphorylation levels of a number of RTKs were altered, including insulin and IGF1 receptors (Fig 4A and S5 Fig). We focused on IGF-1R/insulin receptor (IR) signalling, as it is known to have a profound effect on neuroplasticity in the CNS [7–9]. Pull-down experiments confirmed that phosphorylation of IGF-IR/InsulinR was decreased in the P7 enriched synaptosomal fraction of Bbs4 −/− mice (Fig 4B). Additionally, phosphorylation levels of Akt, a downstream target of canonical IGF signalling, were significantly reduced (Fig 4B). Next, we tested the phosphorylation level of insulin receptor substrate P53 (IRS p58), an adaptor protein that is phosphorylated by IR and IGF-1R [26]. Interestingly, IRS p58 protein has previously been shown to be highly enriched in the PSD of glutamatergic synapses, highlighting the role of this protein in neurons [27]. We found that phosphorylation of IRS p58 was significantly reduced in synaptosomal fractions of P7 Bbs4 −/− mice (Fig 4B). Furthermore, as the activities of IGF-1R and IRS p58 depend on interaction with Rho family GTPases [28, 29], we investigated the activities of Rac1 and RhoA GTPases. We observed that activity of RhoA was increased and, concurrently, Rac1 activity was decreased in the enriched synaptosomal fraction of P7 Bbs4 −/− mice (Fig 4C and 4D). We next assessed whether dysregulation of IGF-1 signalling in Bbs −/− mice affects the levels of N-methyl-D-aspartate (NMDA) and Alpha-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazole Propionic Acid (AMPA) receptors in the total and synaptosomal fractions of Bbs4 −/− and Bbs4 +/+ mice by western blotting. We observed a significant increase in the level of NMDA and AMPA receptors in the synaptosomal fraction of P7 Bbs4 −/− mice, whereas no changes in the receptors’ levels in the total brain fraction were detected (Fig 4E). These data are consistent with our previous findings of increased mEPSC amplitudes in Bbs4 −/− neurons (Fig 3E), suggesting a compensatory mechanism in response to spine loss.

(A) Phospho-RTK array reveals significant decrease in phosphorylation of insulin and IGF1 receptors in Bbs4 −/− (N = 2, mean ± SD). (B) Pull-down analysis shows aberrant IGF-1R downstream signalling. Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ enriched synaptosomal fractions were incubated with mouse anti-phosphotyrosine antibody overnight, followed by incubation with Dynabeads M-280 for 2 hours. Immunoblotting analysis of the proteins eluted from the beads was performed using anti-IGFR/InsR, anti-Akt, and anti-IRS p58 antibodies. Input: the total brain protein fraction before the incubation with anti-phosphotyrosine antibody, which indicates the total level of IGFR/InsR, Akt, and IRS p58 in Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice. (C, D) RhoA and Rac1 G-LISA Activation Assays. Levels of activated RhoA (c) and Rac1 (d) were measured in the total brain extracts and enriched synaptosomal fraction of Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice (N = 3, mean ± SD unpaired t test). (E) Representative image of western blot analysis of NMDA and AMPA receptors levels in the total brain extract and enriched synaptosomal fraction of Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice. (F) Representative western blots of autophagy markers LC3-II and p62 in the synaptosomal fractions of Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice at P1, P7, P14, and P21 (N = 3, mean ± SD). LC3-I is a cytosolic form of LC3. LC3-II is a LC3-phosphatidylethanolamine conjugate (LC3-II), which is recruited to autophagosomal membranes. LC3-II and p62 levels were quantified by measuring western blot band intensities using the Image J programme (N = 3, mean ± SD, unpaired t test). Housekeeping genes (actin, GAPDH, etc.) could not be used as normalisation controls due to the changes in their gene expression levels in Bbs4 −/− mice (our unpublished observations). (G) Measurement of oxidative phosphorylation (OXPHOS) complex activities in the whole brain homogenates of Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice. Units: mU:U CS raw data were normalised to citrate synthase N = 4, mean ± SD ns, not significant unpaired t toets. Underlying data are available in S2 Data. AMPAR, alpha-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazole Propionic Acid receptor NMDAR, N-methyl-D-aspartate receptor Bbs4, Bardet-Biedl syndrome 4 CI, mitochondria complex I CII, mitochondria complex II CIII, mitochondria complex III CS, citrate synthase, GAPDH, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GluR, glutamate receptor IGF-1R, insulin-like growth factor receptor InsR, insulin receptor LC3, microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 LC3-I, cytosolic form of LC3 LC3-II, LC3-phosphatidylethanolamine conjugate recruited to autophagosomal membranes OXPHOS, oxidative phosphorylation RTK, tyrosine kinase receptor SCC, succinate:cytochrome c oxidoreductase (= complex II + III combined) WB, western blot.

One of the possible mechanisms of dendritic spine pruning is macroautophagy [18], a process that is tightly regulated by IGF-1R signalling and small GTPases. To test whether autophagy is dysregulated in our Bbs model, we analysed the level of autophagy markers LC3-II and p62 in the enriched synaptosomal fractions isolated from Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice brains at different postnatal stages. We observed a significant increase in LC3-II level at P1 and P7 of Bbs4 −/− mice (Fig 4F). Given the widely recognised notion that the level of p62 correlates inversely with autophagy, it was unexpected to see an increase in p62 in P1 synaptosomes in our experiment. However, it is in line with reports that p62 levels can be up-regulated during high autophagic flux due to a multifunctional role for p62 [30]. To exclude mitochondrial dysfunction and oxidative stress as triggers of autophagic induction [31], we assessed the activities of respiratory chain complexes I, II, III, IV and succinate:cytochrome c oxidoreductase (SCC complex II and III combined) in total brain homogenates of P7 Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice. Oxidative phosphorylation (OXPHOS) complex activities were determined, and the results were normalised to the activity of citrate synthase (CS). We found no significant differences in the activities of OXPHOS between Bbs4 −/− en Bbs4 +/+ mice (Fig 4G), thus ruling out mitochondrial dysfunction as a cause of autophagy in BBS. Together, our findings suggest that aberrant IGF-1 signalling may lead to dysregulation of various cellular pathways that are known to control dendritic spine morphology and plasticity.

Synaptic localisation of BBS proteins

The role of Bbs proteins in the regulation of primary cilia has been recently broadened by studies showing that Bbs proteins are involved in microtubular stabilisation, actin remodelling, transcriptional regulation, and endosomal trafficking [16,17,32]. Taking into account this broad spectrum of Bbs functions as well as our current results elaborating the role of Bbs, such as reduction in dendritic spine density along with aberrant synaptic IGF receptor signalling and altered neurotransmitter receptor levels (NMDA and AMPA), we hypothesised that Bbs proteins may play a vital role in neuronal synapses. Re-evaluation of our earlier mass spectrometric analyses of synaptosomal [33,34] and crude synaptosomal fractions [35] of the rat cortex, dorsal striatum, and DG revealed the presence of Bbs1, Bbs2, Bbs4, Bbs5, Bbs7, and Bbs10 proteins (S1 Table).

To elaborate on synaptic localisation of BBS proteins biochemically, we enriched the cytosolic, detergent-soluble synaptosomal (DSS pre-synapse enriched), and PSD fractions of synaptosomal preparations from adult rat hippocampi using a previously described method (S6 Fig) [36]. Label-free MS1 intensity-based LC-MS quantitation revealed a high abundance of Bbs1, Bbs2, Bbs5, and Bbs9 proteins in the PSD fraction, whereas Bbs7 was present mostly in the cytosolic fraction (Fig 5A and 5B). A low level of Bbs4 protein was also unambiguously identified in the PSD fractions (Fig 5A and 5B). Immunofluorescence analysis of Bbs4 and Bbs5 localisation confirmed the presence of Bbs punctae throughout the entire dendritic tree of mouse dissociated hippocampal neurons (Fig 5C and S7A–S7C Fig). Collectively, these data clearly indicate the presence of Bbs proteins in neuronal processes and PSDs.

(A) Proteomic profile of the BBS proteins in biochemical fractions using nano-LC-MS/MS analysis. Protein levels of Bbs proteins and synaptic markers were estimated by label-free LC-MS analyses from following biochemical fractions of the rat hippocampi: cytosolic, detergent-soluble synaptosomal preparation (DSS, pre-synapse enriched), and postsynaptic density preparation (PSD). Protein levels of the presynaptic (VGLU1, SYP) and postsynaptic (NMDAR1, PSD95) protein markers are enriched in DSS and PSD preparations, respectively. (B) The protein abundances illustrated in the heat map are obtained from the total MS1 peptide intensities scaled to the mean of all the samples. Protein levels of the presynaptic (VGLU1, SYP) and postsynaptic (NMDAR1, PSD95) protein markers are enriched in DSS and PSD preparations, respectively. (C) Representative image of immunolabelling of Bbs proteins. Cultured mouse hippocampal neurons at low density were immunolabelled with Bbs4 and Bbs5 antibodies (red), phalloidin (green), and beta-III tubulin (green) after 6 days in vitro (DIV6). Scale bar, 20 μm (top panel) and 5 μm (bottom panels). Underlying data are available in S4 Data. BBS, Bardet-Biedl syndrome DIV6, six days in vitro hippocampal culture DSS, detergent-soluble synaptosomal LC-MS/MS, liquid chromatography- tandem mass spectrometry MS, mass spectrometry NMDAR1, N-methyl-D-aspartate receptor 1 PSD, postsynaptic density SYP, synaptophysin TUBB3, β-tubulin III encoded by TIBB3 gene VGLU1, vesicular glutamate transporter 1.


ELI5: Why do neurons connect as synapses instead of physically connecting to each other?

The synapses you're thinking of - as do most people - are called chemical synapses. As you know, between communicating neurons there is a small gap called a synaptic cleft. Neurotransmitters are small chemicals that leave one neuron (the PREsynaptic neuron) and move across the synaptic cleft to alter the state of the next neuron (the POSTsynaptic neuron). The cells do not touch for a few reasons.

All animal cells, including neurons, have a barrier surrounding them called a plasma membrane. Neurotransmitters in the presynaptic neuron leave in a complex process where balls with neurotransmitters inside (called vesicles) fuse with this plasma membrane and release the chemicals. These then move across the synapse and interact with the outside of the postsynaptic cell at specific reception points. If the postsynaptic cell was touching the presynaptic cell, neurotransmitters would not often be in the right place to interact with these receptors.

You may imagine that there would not be a membrane between the two neurons, but this would not allow differentiation of the kinds of signals neurons send. Some neurons have neurotransmitters that excite the postsynaptic neuron, while some stop it from activating or have a different effect. If two neurons were a continuous cell, when one cell activated, the electric charge would travel to the next. This maybe could work in some neurons, but not in neurons that stop the next neuron from activating.

tldr if neurons touched they wouldn't be able to send signals to other neurons.


Bekijk de video: Pepijn van Houwelingen fileert het financiële wanbeleid van Hoekstra! (Januari- 2022).